人类蠕虫线粒体基因组及其在种群遗传学和种系发生学中作为标记的应用

1、童的研究发现 , 在出生时母亲 M F 阳性的儿 童比母亲 MF 阴性的儿童的 IgG 4抗体水平 要高 , 尽管在母亲 M F 阴性的儿童中 Ig E 抗 体水平较高 , 而 IgG1, IgG2, IgG3的水平不 随母体状况而改变。这种发现暗示儿童出生 后的免疫反应与母亲感染状况有关。 3. 5淋巴细胞反应及其临床相关性在儿童中对丝虫抗原刺激引起的淋巴细 胞反应的研究结果概括如下 :1 流行人群中 M F 阴性的儿童比 M F 阳性的儿童有较高的 持久的增生性反应 , 且与年龄无关。 相同的结 果也见于抗原阴性或阳性者。 2 M F 阴性的 儿童反应要比 M F 阴性的成人强。 3 儿童

2、出 生时母亲 M F 阳性的状况似乎消除了由抗原 刺激引起的外周血单核细胞增生反应 , 甚至 在 MF 阴性的年龄在 17-19岁的儿童。 4 在 M F 阴性的儿 童和母亲 M F 阳性 的儿童 之 间 , 由抗原刺激引起的脐带血单核细胞增生 反应无显著性差异。对 LF 流行区的儿童细胞因子的产生也 有研究 , 发现那些母亲 MF 阳性的儿童的细 胞 因子 (IL-2, IL-4, IL-10, INF- 和巨 噬细 胞集落刺激因子明显低于母亲 M F 阴性的儿 童。 尽管这种差异在青少年时期可见 , 但在新 生儿中不明显。4结语越来越多的研究表明儿童中存在丝虫病 并具有明显的临床表现。 但

3、是 , 还有许多问题值得进一步研究 :如母亲作为儿童感染的危 险因素应进一步探讨 ; 丝虫感染引起的淋巴 性腺病和淋巴性腺炎如何与由病毒或细菌引 起的区别 ; 感染后的免疫应答表现如何等。 但 目前首先应考虑的是怎样来治疗和预防儿童 感染 , 以使儿童能得到较好的照顾而阻断传 播和流行。这对新近提出的丝虫病作为一种 可被消灭的疾病和把消灭疾病作一个全球性 的公共卫生问题的世界大会决议的实施起着 重要的作用。主要参考文献1 A lex ander N D et al. A m J T ro p M ed Hy g , 1999;61(2 :319-3242 A mar al F et a l.

4、A m J T r op M ed Hyg , 1994; 50(6 :753-7573 Chanteau S et al. Int P arasitol, 1995; 25(1 :81-854 Co opre PJ et al. J Infect Dis, 1998; 178(4 :1133-1138(收稿日期 :2002年 3月 26日 人类蠕虫线粒体基因组及其在种群遗传学和种系发生学中作为标记的应用第一军医大学热带医学研究所骆利敏编译李明吴英松审校摘要 目前己报道了 100多种寄生虫的全长线粒体基因组。本文主要总结了后生动物门的 线粒体基因结构 , 并且回顾了人类线虫 和扁虫线粒体基因

5、组的研究状况。一些蠕 虫的全长或近于 全长的线粒体基因组的发现 , 为蠕虫的种 系发生分析和遗传变 异性研究提供了极 为丰富的遗传标 记。本文举例说明了线粒体基因组在蛔虫、 盘尾丝虫、 血吸虫、 片形属吸虫、 并殖吸虫、 棘口吸虫、 棘 球绦虫和绦虫属的研究中的应用。关键词 蠕虫线粒体基因组种群 遗传学、 种系发生学1线粒体基因组简介细胞内大部分生命活动。 但是 , 几乎所有的真 21 国外医学寄生虫病分册的线粒 体 基因 组。在 脊 椎动 物 门 , 线 粒 体 DNA (mtDNA 是以多 拷贝形式 存在的 , 通 常一个细胞中包含了 100-1000拷贝的线 粒体 DNA 。这些 线粒体

6、 DN A 决定着 合成 AT P 的呼吸酶链复合体中 12-13种蛋白的 表达 , 而线粒体的其它成份则由细胞核基因 组编码并通过特 殊的转运系统转运入 线粒 体。 线粒体基因组被认为是纯系的 , 很少或从 不重组。 父系线粒体基因很少进入合子 , 即使 进入也不能持久 , 因此 , 线粒体 DNA 是母系 遗传的。除了某 些刺 胞 动物 (比 如说 水螅 属 动 物 , 所有动物都包含了小的环形的线粒体分 子 , 大小约在 14-40kb 之间 , 其中大部分在 16-20kb 之间。 目前为止 , 已报道了 100多 种不同种类寄生虫的全长线粒体基因组 , 其 中约有 70种来自脊索动物

7、门。除了少数例 外 , 不同种属的线粒体基因组的组成和核苷 酸序列是高度保守的 , 大部分线粒体基因组 包含了 37个遗传因子 :2个核糖体 RNA , 22个转运 RNA , 13个蛋白编码基因。 基因组结 构是致密的 , 部分基因重叠 , 但大部分基因是 彼此毗连的 , 或者被短的基因间隔区隔开。 在后生动物门 , 线粒体包含了至少一个 相对大的非编码区基因 , 后者阻碍了启动子 的启动转录作用。 在脊椎动物中 , 该非编码区 被称为 D -环结构 , 在其它分类群中 , 它指的 是富含 A 和 T 的区域或指控制区域。 线粒体 基因组的通用密码子和其它特征是不同于细 胞核基因组成的 ,

8、这反应了线粒体的真菌性 起源。 和核基因组相同 , 线粒体基因组蛋白编 码 区 的转 录 起 始密 码 子 是 蛋氨 酸 密 码 子 AT G 。但在其它无脊椎动物种群 , 转录起始 密码子可以是 AT T , ATA , 或 GTG 。2寄生性蠕虫的线粒体基因组第一个被报道的寄生性蠕虫全长线粒体 基因组是猪蛔虫 (A scaris suum 的线粒体基 因 , (Meloidogy ne j av anica 和 寄 生 性 蚊 (R o -manomerm is culicivor ax 的 全 长 线 粒 体 DNA 序列。 之后被进行全长测序的寄生性线 虫 线 粒 体 基 因 组是 盘

9、 尾 丝 虫 (Onchocer ca volvulus 的 mtDNA , 基因 组大小 为 13747 kb, 比猪蛔虫略小一些。与线虫形成鲜明对比的是 , 我们对于扁 形动物的了 解 , 到目前为 止 , 仍是非常 局限 的。直到 1999年 , 第一个全长线粒体基因组 序列 , 多房棘球绦虫 (Echinococcus m ultilocu -lar is 的 线 粒 体 基 因 组 , 才 被 存 放 入 Gen-Bank 数据库 (GenBank 登录号 AB 018440 。 虽然 , 肝片形吸虫 (Fasciola hep atica 的部分 线粒 体 DNA 序 列早 就 被

10、 获 得。 Zurita 等 (1998 建立了 cDNA 文库并 发现了一个包 含 r rn L 基因的长约 710个碱基的部分转录 子 的克隆。 Gar y 和 Wo lstenholm e(1998 合 成了可以产生约 3466个碱基长的线粒体序 列的重叠基因组克隆 , 其中有 nad 1, nad 3和 cox 1基 因 以 及 某 些 tRNAs 。 Chapman 等 (1995 克隆牛带绦虫的 cox 1基因的部分片 段并进行测序。更多的推断的线粒体 DNA 序列在曼氏血吸虫 (S chistosoma mansoni 的 cDNA 文库被发 现 , 而且 , 利用 cDNA 文

11、 库 筛 选的 方法 , 曼 氏血吸虫 的 nad 5(1. 6kb (GenBank 登录 号 :AF 085145 和 cox 1(1. 8 kb (GenBank 登录号 :AF 101196 的全长或 近于全长基因序列被存放入 GenBank/EM-BL 数据库。通过获取许多扁虫 (包括一些血吸虫种 属 的线粒体 DNA 序列和基因次序可以发 现更多的线粒体 DNA 标记。我们获得了跨 越曼氏血吸虫线粒体基因组过半编码区的全 长 约 8068bp 的序 列 , 其 中 包括 了 rr n L , rr n S, cox 3, nad 3, nad 4, nad 6, ap t 6和预期

12、的 22种 tRNA 中的 10种 tRNA 的全长序列以 及 cox 1, nad 2和 cob 基因的非全长序列。 所获得的曼氏血吸虫巴西株 (m s-BRE-22 2003年 1月第 30卷第 1期用于设计低聚寡核苷酸 , 而后者则被用于扩 增波多黎各株线粒体基因组的长 PCR 技术 中。长约 8. 8bp 的重叠片段被产生 , 克隆和 用引物 w alking 法测序 , 巴西株和波多黎各 株的基因序列几乎是相同的。曼氏血吸虫中存在非编码可变区 VN R (variable non-coding region 。 Despres 等在 以往的工作基础上 , 用不同的限制性内切酶 消化不

13、同株的曼氏血吸虫的线粒体 DNA , 发 现在 8株非洲和拉丁美洲曼氏血吸虫中 , 基 因组的长度从 16. 6kb 变化到 24. 9bp 。 其中 ms -BRE -2株和 m s -VEN -1株的长度异质性 表明 , 在血吸虫种群中发生了组织变形 (两个 线粒体分子组织在同一个体中 。 株间的长度 区别是因为该分子的部分片段内部无限制性 酶切位点 (在剩余的 15kb 片段中 , 发现了多 个限制性酶切位点 , 这证明了可变区域包含 了相对短的重复序列或简单序列片段 , 这也 是其它种属动物非编码区的典型特征。与此 相似的是 , 当 Pena 等在 1995年消化曼氏血 吸虫巴西株的线

14、粒体 DNA (基因组长度约为 23kb 时 , 观察 到一 个长约 9. 4kb 的片 段 (与 Despres 等在 1991和 1993年 的研究中 发现的可变区域相对应 , 在其中没有所应用 的 9种限制性内切酶中任何一种酶的识别位 点。当用 Dde I 酶切时 , 该片段消失 , 琼脂糖 凝胶电泳分析出现了约 620bp 的主要条带 和一些比较小的条带。进一步的实验和测序 表明 , 可变区域包含了由 558bp 和 62bp 两 种 重 复基 序 组 成的 一 个 大 的多 态 小 卫 星 DNA 。该小卫星区域的 PCR 扩增被用于光 滑双脐螺 (B . glabrat 中曼氏血吸

15、 虫感染的 检测。有趣的是 , 不管是大片段重复基序 , 还 是小片段重复基序 , 都和 SM 750分子克隆有 显著的相似性。较小的片段和该分子的多态 性重复基序相同 , 而后者在 SM 750中除了以 串联的 5个拷贝形式表达外 , 还贯穿了整个 基因组 , 尤其在转录子中 , 含量更为丰富。 3线粒体 DNA 序列变异用 作种群遗传学 和种系发生研究的标记动物线粒体 DNA 序列的进化要快于细 胞核基因 , 适合于区别亲缘关系较近的生物 有机体。 事实上 , 我们关于许多真核生物种群 进化和种群遗传学的了解在很大程度上要归 功于线粒体 DNA 的研究。 而且 , 线粒体基因 组中的突变和

16、基因重组通常并不复杂且具有 种属特异性 , 因此对于种间和种内变异的研 究具有巨大价值。从线粒体基因组获得的序 列提供了优良的分子标记 , 该标记可用于种 群分类 , 跟踪某一个体或与该个体相关的特 殊种群的遗传史 , 可用于构建系统发生的分 类学分支。不同编码区的突变发生率差异很 大 , 因此 , 在回答关于生物学关联性的特殊问 题时 , 它们作用也是不同的。 r RNA 和 tRNA 的基因序列最保守 , 而非编码调控区 , 无论是 基因长度还是核苷酸序列 , 在基因组中都是 变异最大的 , 该区被用于脊椎动物许多种内 特异性研究 , 但是关于它们的结构和在无脊 椎动物中的应用 , 人们知

17、之甚少。众所周知 , 营自由生活的生物体在许多 重要的生物学特征上有变异 , 对于寄生虫来 说 , 情况是一样的。 因为这些变异与流行病学 的关联性 , 对它们进行研究就变得极为重要。 变异性是种群分子发展进化的结果 , 对实验 数据的解释也必须考虑到这一点。某些蠕虫 种群的全长或近于全长线粒体 DNA 序列的 获得 , 为蠕虫种群种系发生分析和遗传变异 研究提供了极为丰富的遗传标记。下面将简 述线粒体 DNA 在蛔虫、 盘尾丝虫、 血 吸虫、 片形属吸虫、 并殖吸虫、 棘口吸虫、 棘球绦虫 和绦虫属的研究中的应用。3. 1蛔虫关于人蛔虫和猪蛔虫的分类学状况 , 存 在许多争议。 事实上 ,

18、关于人源性蛔虫是否与 猪源性蛔虫有显著不同 , 也引起了很多争论。 虽然进行了关于该主题的研究 , 实验性交叉 23国外医学寄生虫病分册之亦然 , 这种争议仍在继续。以线粒体 DNA 和细胞核 rRNA 为标靶的 DNA 方法也未能 解决这个问题。 在世界上很多区域都发现 , 蛔 虫亚种在人类和猪类中同域分布 , 事实上 , 从 两种宿主获得的寄生虫在形态学和生物化学 标准上是无法区分的 , 这说明这两种寄生虫 应被看作同胞株。该问题的最后解决需要这 两种寄生虫的相互交配试验 , 并对子代进行 分子水平上的分析 , 以决定是否成功地获得 了杂交子代。3. 2盘尾丝虫在热带和亚热带非洲、 亚洲、

19、 南太平洋地 区、 中美洲和南美洲的隔离区 , 盘尾丝虫属感 染仍是威胁人类健康的一大问题。一系列研 究提供的间接证据表明 , 病原性寄生虫旋盘 尾丝虫是一个突出的遗传变种。 除了 0-150序列 , 盘尾丝虫属的 DNA 变异水 平比较局 限。对盘尾丝虫 属的高变 AT 区 , 用 PCR-RFLP 组合方法和直接测序法进行研究 , 来 自非洲东部和西部的 6个不同的地理区域的 11个被检查个体中 , 仅发现了非常有限的变 异 , 美洲的情况也一样。3. 3血吸虫在寄生于人类的血吸虫中 , 感染性、 致病 性及免疫原性是遗传变种的生物学特征。为 了研 究血 吸虫线 粒体 DNA 的相 对进化

20、 频 率 , Despres 等在 1991-1993年用 RFLP 法 绘制线粒体基因组图谱 , 用测序分析法比较 许 多 非洲 和 拉 丁美 洲 起 源 的曼 氏 血 吸 虫 rrn L 基 因。 不同 类 型 间 的 核 苷 酸 差 异 在 0. 35%-1. 42%之间。 用 PCR 扩增和直接测 序 法 获得 了 曼 氏血 吸 虫 和 日本 血 吸 虫 的 cox 1基 因 的 372bp 片 段 , 日 本 血 吸 虫 的 nad 1基因 474bp 片段 , 同时还获 得了湄公 血吸虫和日本血吸虫中国大陆、 中国台湾、 印 尼、 日本和费城不同地理分离株的 cox 1基因 序列。

21、 Bow les 等在 1995年还获得了埃及血 吸虫和间插血吸虫的 cox 1基因序列。 用相同 南、 湖 北和四川等地理分离株 的 nad 1基因 的 474bp 序列进行了测定。总体看来 , 日本 血吸虫各地理分离株的 cox 1基因和 nad 1基 因的序列分析结果表明株间的变异水平非常 低。 Bogh 利用 SSCP 法可以真实地显示 cox 1和 nad 1基因片段的低水 平变异 , 从而 为日 本血吸虫种群遗传结构和生物学的研究 , 为 线粒体 DNA 的遗传分析提供了重要线索。 而 且 , So rensen 和 他 的 工作 组 能 够 用 nad 1基因作为遗传标记检出日本

22、血吸虫在 终宿主内的持续性感染 , 或将该标记用于猪 和鼠体内血吸虫感染的种群动力学研究。对 从中国获得的不同地理分离株的日本血吸虫 的 nad 1基因的 474bp 片段 , 用 PCR 扩增和 直接测序法进行分析 , 结果提示了非常有限 的序列变异 (0-0. 6% 。然而 , nad 1序列以 PCR 为基础的 RFLP 分析显示 , 在四川省的 一个分离株中 , 有个核苷酸的差异是性特异 性的 , 表明日本血吸虫的线粒体 DNA 并非 总是母系遗传的。进一步研究发现 , 从安徽省收集的地理 分离株中 , nad 1序列的某种程度的分离株间 变异是明显的。但在从某些省收集来的分离 株库中

23、 , 该现象并不明显。 从安徽省直接收集 来的少数变种的 nad 1序列中含有 Rsa I 限制 性酶切位点 (在第 195位核苷酸位点 这个限 制性位点在浙江分离株的所有个体中得到验 证。 当用 PCR-RFLP 法区别日本血吸虫的安 徽分离株和浙江分离株时 , 人们利用了它们 之间的这种差异。在用不同的寄生虫株进行 持续性诱发感染试验以描述日本血吸虫的群 组分类轮廊图时 , nad 1序 列中的 R sa I 位点 的存在或缺失提供了极为有用的标记。 3. 4片形属吸虫在片形属吸虫中最常见的种类是形态上 较为特别的巨片 形吸虫 (F . gigantica 和肝 片形吸虫 (Fasciol

24、a hep atica 。 前者在较温暖 的地方较易发现 , 而后者喜较冷的地区。 它们 ,24 2003年 1月第 30卷第 1期的现象 , 即所有的肝吸虫标本均为单性生殖 的 , 其中有许多是三倍体 (虽然也发现了单倍 体和多倍体 。 而且它们在形态上发生了很大 变异 , 从而为分类学带来了很大混乱。 其中一 些标本与肝片形吸虫类似 , 一些和巨片形吸 虫类似 , 而其余的则是介于两者之间的中间 形态。 应用分歧酶进行的研究发现 , 在日本单 性生殖三倍体中有 3种不同的基因型 , 这说 明三倍体的出现已不止一次了。该谱系中的 某一种的某些等位基因的表达 , 与美国和澳 大利亚的肝片形吸虫

25、相类似 , 虽然有人认为 日本血吸虫是肝片形吸虫和巨片形吸虫的杂 交产物 , 但该研究并没有包括巨片形吸虫的 标本。 Southern 杂交试验、 rDNA 基因测序 和线粒体 cox 1基因测序的结果表明 , 日本血 吸虫在遗传学上非常接近于巨片形吸虫。用 RFLP 方法比较从日本、 马来西亚的肝片形 吸虫和澳大利亚的肝片形吸虫获得的部分纯 化线粒体 DNA , 观察到的系谱有明显的地理 差异 , 但更多的区带表现为介于日本血吸虫 和巨片形吸虫标本之间 , 而不是它们中的某 一种或澳大利亚肝片形吸虫。3. 5并殖吸虫已经报道的并殖吸虫大约有 50种 , 在种 群水平上 , 线粒体序列 (与细

26、胞核基因 IT S2序列连接 通常被用于检查种中间某两组是 否具有同一性。 根据线粒体 cox 1基因构建的 种系发生树表明 , 中国、 日本、 朝鲜和中国台 湾的并殖吸虫在亲缘关系上很接近。在上述 区域内 , 并殖吸虫的单倍体 , 单性生殖三倍体 均可被发现。这些并殖吸虫通常是同域分布 的 , 在中国的东北部还发现了并殖吸虫的四 倍体。 三倍体形态较大 , 可以产生较多的卵细 胞 , 而且在人体内具有比单倍体更强的致病 性。 在并殖吸虫的其它分布区域内 , 仅有单倍 体存在。 三倍体不能凭借它们的线粒体 cox 1基因和单倍体相区别。 也有学者认为 , 三倍体 是一个独立的种属 , 但是该假

27、说到目前为止 因组得到的证据表明 , 三倍体谱系可能出现 了不止一次。南亚的卫氏并殖吸虫在线粒体 cox 1基因序列上彼此有很大不同 , 和东亚种 群的线粒体 cox 1基因序列尤为不同。 南亚种 群和东亚种群有显著不同 , 因此它们寄生在 不同的螺宿主中。存在于日本的并殖吸虫有大平并殖吸虫 (P . ohir ai 和佐渡并殖吸 虫 (P . sadoensis , 它们的成虫无显著区别 , 但它们的囊蚴包囊 形态和中间宿主特异性有显著差别。大平并 殖吸虫和怡乐村并殖吸虫 (P . iloktseunensis 包囊间的不同可能归因于一个简单的遗传多 态性。 分歧酶研究和实验性交叉感染表明

28、, 所 有存在于日本的并殖吸虫都可以互换基因 , 有人认为 , 所有的 3种并殖吸虫都是同种的 , 线粒体 cox 1基因序列分析支持这一观点。 使用线粒体基因序列研究并殖吸虫种属 在分子水平上的种系发生 , 使对一些不同种 属的并殖吸虫的认识成为可能 , 其中有一些 种属以往尚未被发现。如卫氏并殖吸虫和暹 罗并殖吸虫 (P . siamensis 组 成了一个 新的 种 群 , 该 种 群 内 含 有 正 并 殖 吸 虫 属 (E u -p aragonimus 的共同基础 , 因此正并殖吸虫 属种群可能被归入并殖吸虫一类。 而且发现 , 来自日本的宫崎并殖吸虫 (P . miy az ak

29、ii 和 来自中国的斯氏狸殖吸虫 (P g . skrj abini 有 密切关系 , 这两个种属的并殖吸虫在人体内 引起的疾病具有类似症状。但是 , 在形态学 上 , 有些研究者把斯氏狸殖吸虫归入一个独 立的狸殖 (吸虫 属 (P agumogonimus 。 3. 6棘口吸虫虽然棘口吸虫属的大部分成员是从其它 哺乳动物和鸟类研究中发现 , 但有一些棘口 吸虫属成员还是可以感染人类的。该种群内 的分类主要依赖形态学上的差别以及很难获 得的生活周期的细节。 因此 , 分子遗传学工具 被用来承担这项任务 , 就丝毫不令人吃惊了。 线粒体序列 (cox 1和 nad 1 被用来鉴定每个 25国外医

30、学寄生虫病分册 26 2003 年 1 月第 30 卷第 1 期 3. 7棘球属绦虫 细粒棘球绦虫幼虫是胆囊棘球蚴病 ( CHD 的病原体。在直接对比试验中, 棘球 蚴的变异是非常局限的。 在早期研究中, 研究 虫株特性通常使用病理学和生物化学方法, 如同工酶标记。 但后来, 更灵敏的分子技术被 用于区分不同的种属和虫株。cox 1 和 nad1 基因的序列比较, 包括使用 SSCP 方法进行 的序列比较, 使目前已知的 4 种棘球属绦虫 和棘球绦虫的遗传变异株的区别鉴定成为可 能。 目前已发现 9 种基因型( G1- G9 。 虽然 通常是普通绵羊株基因型( G 1 与人类感染 有关, 但并

31、不总是只有 G1 型与人类感染有 关, 其它基因型也可感染人类, 只是感染力强 弱不同。以从不同国家收集的棘球绦虫为原 材料, 利用基因型和相关的 DNA 技术进行 虫株调查, 以描绘目前已知基因型的宿主及 地理分布范围。线粒体 DNA 数据已和细胞 核 DNA 序列( 核糖体 IT S 1 结合起来, 用以 协助解决棘球属绦虫不同种和虫株间的种系 发生问题。 3. 8绦虫 人 类 了 解 较深 入 的 牛带 绦 虫 ( T aenia saginata 和猪带绦虫( T . sol ium 是重要的人 类寄生虫。另外一种人类绦虫, 亚洲带绦虫 ( T aenia asiat ica 也在东亚发现。 因为它最早 在中国台湾被发现, 因此也被称为台湾绦虫。 现在有证据表明, 这种寄生虫还存在于其他 地区,