生物技术试验讲义

1、生物工程专业实验讲义适用于生物工程专业 曹飞制药与生命科学学院二零零九年四月目录实验一 发酵种子的制备1实验二 E.COli 和 Pseudomonas dacunhae 2021 发酵培养2实验三高速冷冻离心机的使用方法.3实验四固定化生物催化剂的制备4实验五游离细胞与固定化细胞酶活比拟 5实验六固定化生物催化剂的连续生产6实验七L- Asp的别离 7实验八L- Asp脱羧反响制备 L-Ala 6实验九离子交换树脂别离L- Al a8实验原理:HOOCCOOH +实验流程:、实验原理与实验流程En zyme 1NH3-HOOCNH2XCOOHEn zyme 2NH2PS20217离子交换树脂

2、预处理L 丙氨酸培养基配制灭菌实验一发酵种子的制备一、目的要求了解实验室种子制备过程。二、原理种子制备过程包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养、摇瓶液体培养和种子罐 培养等多级扩大培养。在实验室里，一般只进行到摇瓶液体培养获得发酵用种子。 不同菌种其具体制备方法不同，下列图是菌种子制备过程示意图。生产种子制备的一般流程三、试验及器材1. 菌种：斜面低温保藏的大肠杆菌 E.coli 和Pseudomonasdacunhae202172. 培养基： E.coli种子培养基：牛肉膏 0.5%、NaCl 0.5%、 蛋白胨1%、 pH 7.67.8P.dacunhae 20217种子培养基：15g/L谷氨

3、酸钠、蛋白胨8g/L、玉米浆5.5 g/L , KH 2PQ 0.5g/L ,MgSO 4 0.1g/L。3. 器材：天平、灭菌锅、试管、三角瓶500mL四、操作方法1. 按种子培养基配方分别配制1000mL液体培养基，分装于三角瓶中，每 瓶100mL，压力1Kg/cm2灭菌30mins，结束后取出。2. 挑一环斜面低温保藏的 E.coli和P.dacunhae 20217接于各自的种子培养 基中，37T培养24hs，转速约150rpm。3. 种子瓶摇好后，及时接种到发酵罐。也可以在冰箱中短时间保藏。五、思考与讨论1. 实验室种子制备的原那么是什么？2. 哪些参数对于实验室种子制备产生影响？实

4、验二 E.coli 和 Pseudomonas dacunhae2021 发酵培养一、目的要求1了解发酵罐的结构，掌握发酵罐的根本操作技术。2了解发酵罐中微生物生长的生长特征。3. 掌握实验室中微生物从斜面f摇瓶f发酵罐的无菌操作培养技术，对工 业化微生物生产过程作出初步了解。4. 掌握酶合成代谢调控机制。5. 掌握发酵工艺控制工艺。二、原理一定数量的微生物，接种于适宜的新鲜培养基中，在适宜的培养条件下，所 表现出的群体生长特征可分为四个时期，即延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。 微生物在各个时期的生理特征各不相同。微生物的生长过程是其总的代谢活动的综合表达， 每一种代谢途径均由一些 特有的酶的

5、反响组成，同时微生物代谢具有高度的调节作用，通过本实验了解酶 合成的调节机制之一酶合成的诱导。三、试剂及器材1. 菌种：实验一液体培养 24h的E.coli和P.dacunhae 20217的实验室种子2. 发酵培养基：E.coli 发酵培养基：玉米浆 4%、富马酸 1%、K2HPO40.5%、MgSO40.25%、 NaCI0.1% (用氨水溶解富马酸后再参加玉米浆和其他成分，用稀盐酸调节 pH为 7.5)，消泡剂 1-2mL，pH 7.5。P.dacunhae 20217发酵培养基：20g/L谷氨酸钠、蛋白胨10 g/L、玉米浆 20 g/L , KHPO0.5g/L ,MgSO 0.1

6、g/L、消泡剂 1-2mL，用氨水调 pH 至。121T，灭菌 20min。通气，冷却至 37C (E.coli)或 30C (P.dacunhae 20217)。4. 器材：发酵罐、灭菌锅、721分光光度计、超净工作台、台式高速离心机、 离心管、移液管。四、操作方法1. 按配方先后配制1000mL发酵培养基，调pH7.5,装入发酵罐中，包扎好各个进气口、出气口和取样口，保持121C下灭菌30mins,结束后取出放在发酵罐台上冷却。2. 待发酵点中的培养基冷却至 37C( E.coli)或30C( P.dacunhae 20217) 左右时，用火环接种法将E.coli和P.dacunhae 2

7、0217种子液接发酵罐 中，接种量1015%控制温度37C或30C，转速约为300rpm,空气流 速1L/min，发酵培养时间E.coli约12h、20217约18h，其中每间隔1-2hr 取样测pH值和OD660值(样品进行适当稀释)纪录发酵全过程中 pH值 和发酵液颜色变化，过程中镜检菌体生长形态变化情况。3. 发酵结束后放罐、收集发酵液并测量其总体积(V)。吸取1 mL发酵液 于离心管中，放入台式高速离心机中离心，转速 8000 rpm，时间10 min， 测湿菌体重(W 计算发酵产菌率。五、实验记录E.coli 发酵：时间(h)0246789101112六、思考与讨论1发酵培养基中碳、

8、氮源是什么？为什么采用富马酸、L-谷氨酸为碳源?2 如何提高发酵效率。3.讨论酶合成生产的调节方式。OD640pH颜色实验三高速冷冻离心机的使用方法一、目的要求1了解高速冰冻离心机的结构、使用方法及考前须知。2. 掌握生物物质、微生物菌体离心别离的原理。二、原理离心机是利用离心力对混合溶液进行别离和沉淀的一种专用仪器，高速冰冻离心机在实验室别离和制备工作中是必不可少的工具，其最高速度可以到达 25000 rpm,最大离心力可达89000g。这类离心机通常带有冷却离心腔的制冷设 备，温度控制是由装在离心腔内的热电偶检测离心腔的温度。高速冰冻离心机有多个内部可变换的角式或甩平式转头，它们大多用于收

9、集微生物菌种细胞碎片， 大的细胞器以及一些沉淀物等。三、试剂与器材E.coli发酵液、天平、高速冰冻离心机、离心管四、操作方法1. 使用前先检查调速旋钮、定时旋钮等是否在“ 0处，离心管是否泄漏。2. 选择适宜的转头安装到离心腔内承载转头的轴上。3. 接通电源，翻开电源开关。4. 将待离心的液体装入适宜的离心管中，盛量不宜过多占管的2/3体积以免益处，盖上离心管盖，精密平衡离心管，并对称的放入转头中。5. 调节速度旋钮和定时旋钮，至所需的速度和时间。6. 翻开起动开关，并观察离心机上的各个指示仪表是否正常工作。7. 离心结束后自动关机、关闭冷冻开关、电源开关、切断电源。8. 将转头取出，将离心

10、机的盖子敞开放置。9. 收集离心物，洗净离心管。五、实验记录：发酵液体积，湿菌体重量 ，单位体积菌体得率，六、考前须知1. 高速离心机的转头是镶置在一个较细的轴上，因此精密的平衡离心管及内含 物是十分重要的。2. 当转头只是局部装载时，管子必须相互对称的放在转头上，以便使负载均匀 地分布在转头的周围。3. 装载溶液时，要根据离心管的具体操作说明进行，要根据离心液体的性质、 体积选择适宜的离心管，液体不得装的过多，以防离心时甩出，造成转头生锈或 者腐蚀。4. 每次使用时，要仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保 护的部件，搬动时不能碰撞，防止造成伤痕。转头长时间不用时，要涂一层光蜡

11、 保护。5. 转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。6. 离心过程中不得随意离开，应随时观察李新机上仪表是否正常工作，并注意 声音有无异常，以便及时排除故障。实验四固定化生物催化剂的制备一、目的要求1学会卡拉胶固定大肠杆菌的操作方法2了解工业化固定生物催化剂的工艺过程二、原理酶和细胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法等。本实验通过卡拉胶包埋法固定大肠杆菌细胞，掌握包埋法固定细胞的操作方法。卡拉胶是由角叉菜提取的一种多糖，它含有许多硫酸根多糖，在存在下,它能立即发生凝胶作用，由此形成的固定化颗粒能在磷酸缓冲液和其他电解质溶 液中使用，其稳定性不受影响。卡拉胶包埋法

12、即温和又简单，可供多种酶和细胞 固定化使用。三、试剂及器材大肠杆菌细胞、卡拉胶、KCl、电炉、天平、恒温水裕锅、量筒、小刀、烧 杯四、操作方法1配制4%卡拉胶水溶液(A)，并冷却至5560C。2配制菌悬液(B)，按湿细胞重与蒸馏水为1: 1 (g/mL)配制，并预热至 5560C。3将A与B按4: 1 (mL/mL )混匀，冷至10C使凝胶强化，把所形成的 凝胶浸在0.3MKCI溶液中。4. 取出凝胶切成5X5mn大小的小块。5测定固定化细胞颗粒的密度、床层空隙率、计算单位体积或重量固定化 颗粒中细胞包埋量。五、实验记录：固定化细胞重量，六、思考与讨论影响卡拉胶固定化细胞颗粒机械强度的因素有哪

13、些？实验五 游离细胞与固定化细胞酶活比拟一、目的要求掌握酶活测定和计算方法二、原理天门冬氨酸酶是催化富马酸和氨转化形成L-Asp的酶：NH2Ho。一 COOH + nHsHOOCCH测定发酵过程中游离细胞酶活和固定化E.coli细胞酶是评价发酵培养条件和固定化方法对大肠杆菌生产 L-Asp能力影响的重要指标之一。三、试剂与器材1试剂：富马酸、氨水2器材：752分光光度计、离心机、电炉、三角瓶、烧杯四、操作方法1. 富马酸标准曲线制作测定范围 525/mL精确称取0.5000g富马酸，配制成0.5mg/mL母液，分别吸取母液0.1 ,0.2 , 0.3 , 0.4 和 0.5mL 母液，定容至

14、10mL 即成 5, 10, 15, 20, 25 卩g/mL富马酸标准溶液，测定各标准液 OD4o值，绘制成标准曲线。2. 1M富马酸铵底物配制：内含 1mM MgC2, pH为8.53. 游离细胞酶活力测定称lg湿细胞，参加30mL底物溶液，于37C下振荡反响1h,取出沸 水灭活，终止反响，离心，取上清液，进行适当稀释，测OD4。4. 固定化细胞颗粒酶活力测定称相当于1g湿细胞的固定化细胞颗粒，加 30ML底物，于37E振荡反响1h,取样离心，适当稀释，测 OD4。1 pg分子底物的酶量定5. 酶活定义：与上述反响条件下，每小时消耗 义为一个酶活单位。五、实验记录：富马酸标准曲线：浓度ug

15、/mL051015202530OD240游离酶活力 固定化细胞活力 有效因子六、思考与讨论1. 为什么采用紫外吸收能够测定酶活力？2. 计算游离细胞和固定化细胞酶活力，并进行比拟，讨论影响固定化细胞 的酶活力的因素。实验六固定化生物催化剂的连续生产一、目的要求了解固定化生物反响器的性能与反响器操作之间的关系二、原理添装于固定床反响器中的具有天门冬氨酸酶活性的固定化大肠杆菌颗粒能连续的利用富马酸和氨作为底物，使之转变为L-Asp，其实验流程如下：底物贮槽一恒流泵一恒温固定床反响器一产品液贮槽在其它反响条件不变的情况下，反应器的性能随反响器的操作流量即原料液在反响器中的停留时间而变化。三、试剂及器

16、材1 M富马酸铵底物内含1m MgC2 pH8.5 、固定床反响器、恒流泵、超级 恒温水浴锅、752分光光度计、烧杯、乳胶管。四、操作方法1. 将具有天冬氨酸酶活性的固定化大肠杆菌颗粒装入固定床反响器中。 连续底物贮槽、循环水等，控制恒温 37 C2. 调节恒流泵至一流量，待反响器流动稳定后测体积流量，并每隔0.5h取样测0D4。值。3. 连续转化4-6h生产L-Asp，测定最终ODk,计算富马酸转化率。五、实验记录：反响器体积 固化细胞体积 床层空隙率时间h00.511.522.534OD240实验七 L-Asp的别离一、目的要求掌握发酵液转化液预处理方法 掌握等电点沉淀法别离氨基酸的方法二

17、、原理富马酸铵底物在天冬氨酸作用下转化为 L-Asp，转化液在低离子强度下，调 pH值至等电点pl2.8使L-Asp所带的静电荷为零，可大大降低L-Asp溶解度， 使L-Asp沉淀出来。所得L-Asp结晶用水洗涤，不需进行重结晶，即可制得纯品。三、试剂及器材60% HSO、活性炭、布氏漏斗、电炉、烘箱、烧杯四、操作方法1. 过滤转化液，除去其中颗粒状杂质，参加活性炭脱色，然后过滤，收集溶液、 测定其体积。2. 加热滤液至90C,用60%2SQ调pH至2.8，然后在15C下保温2h,即有L-Asp 结晶析出。3. 过滤收集L-Asp晶体，用蒸馏水淋洗，过滤得 L-Asp纯晶体。4. 于烘箱中60

18、E烘干至恒重，称重。五、实验记录：L-Asp 质量 ，单位时间生产能力，六、思考与讨论1. 计算L-Asp理论得率和实际收率，并对结果进行讨论。2. 计算固定化反响器生产L-Asp能力并讨论之单位时间反响器生产 L - ASP量固定化反响器中生产能力=反响器中颗粒床层总体积实验八 L- Asp脱羧反响制备L-Ala目的要求掌握L-Asp生物脱羧反响制备L-Ala的方法，以及反响-别离耦合方法制备 L-Ala的根本原理。二、原理NH2NH2HOOC COOHHOOC采用具有L-天冬氨酸脱羧酶的P.dacunhae 20217发酵液，在pH5-6的条件 下，不断催化L-天冬氨酸脱羧产生L-丙氨酸。

19、L-天冬氨酸在水溶液中溶解度较 小，以固体形式存在，反响过程中伴随着脱羧产生大量的CO气泡，而产生的L-丙氨酸的溶解度较大，能够局部溶解在发酵液中。但随着L-丙氨酸的不断生成，超过其饱和溶解度，就会在反响器内析出。此后再添加L-天冬氨酸进行脱羧反应，就会形成边底物溶解反响、边产物生成析出的、连续的反响-别离耦合过程。三、试剂及器材P.dacunhae 20217发酵液、L-Asp、三角瓶、摇床。四、操作方法1. 取两个三角瓶，各放置 P.dacunhae 20217发酵液100mL参加0.05gEDTA2. 各称取5g L-Asp参加到发酵液中，控制pH5-6,放置在摇床上，控制37C,转速低

20、于50rpm,进行转化；3. 待反响2h后，测定转化液pH值，观察摇瓶内底物是否溶解完全，是否产生气泡。假设已经完全溶解并产生大量气泡，那么补加2g L-Asp，调节pH5-6。4. 此后，每隔1h观察一次，并补加2g L-Asp ;5. 待反响10h后，将其中一瓶取下，准备进行离交别离，另外一瓶继续进行补加L-Asp至出现L-Ala晶体。五、实验记录：1、 参加L-Asp量，2、取初始参加L-Asp、转化6h和12h的转化液进行纸层析，观察转化 情况。六、思考与讨论1. 反响-别离耦合反响过程有哪些类型？2. 参加EDTA勺目的是什么？实验九 离子交换法别离 L-Ala一、目的要求1. 学会

21、离子交换树脂的预处理方法。2. 掌握离子交换树脂的作用原理和操作技术。二、原理 离子交换树脂是一种合成的高聚物， 不溶于水，能吸水膨胀。 高聚物分子由 能电离的性基团及非极性的树脂组成。 极性基团上的离子能与溶液中的离子起交 换作用，而非极性的树脂本身物性不变。 通常离子交换树脂按所带的基团分为强 酸=R= S03H弱=COOH强碱=Nu R:和弱碱=NH舉 NH陰 NR2。离子交换树脂别离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比拟理想的。 但对生物大于物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构 中。故如别离生物大子、 可选用以多糖聚合物如纤维素、 葡聚糖为载体的离子交 换剂。本实验用磺酸阳离子交换树脂别离酸性氨基酸 天冬氨酸 、中性氨基酸 丙氨酸 的混合液。在特定的 pH 条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的 pH或离子强度可分别洗脱别离。三、试剂与器材 层析柱；磨口滴液漏斗；试管及试管架；紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂 732树脂，交换容量 4.5mmol/g 、 2molL HCl、2molL NaOH