急性白血病患者白血病细胞DNA拓扑异构酶Ⅱ活性与多药耐药的研究

1、急性白血病患者白血病细胞DNA拓扑异构酶活性与多药耐药的研究摘要目的：探讨急性白血病患者白血病细胞DNA拓扑异构酶(DNA Topo)活性与多药耐药的关系。方法：采用溴乙锭荧光法对17例初治化疗前及20例化疗后的急性白血病患者外周血或骨髓白血病细胞DNA Topo活性进行测定，采用抗多药耐药单抗JSB-检测18例化疗后患者p-糖蛋白表达，采用RT-PCR法检测mdr-1基因表达。结果：白血病患者化疗前组Topo活性(0.64150.0561)较健康对照组(0.23040.0591)显著增高(P0.005)。化疗后患者白血病细胞Topo活性(0.35630.1011)较化疗前组显著降低(P0.0

2、5)。15例临床疗效差，其中12例p170及mdr-1基因表达阳性、3例表达阴性，而Topo活性均降低。结论：Topo活性下降可能是患者对抗肿瘤药表现耐药的另一重要原因。关键词白血病，急性拓扑异构酶抗药性，多药 Study on the relationship between DNA topoisomerase activity and multidrug resistance in leukemic cellsZheng Wenli, Xie Zhaoxia, Tang Guocheng, et al. Department of Hematology, Xiangya Hospital,

3、 Hunan Medical University, Changsha410008AbstractObjective:To explore the relationship between DNA topoisomerase (Topo ) activity and multidrug resistance in acute leukemia(AL). Methods: Topo activities were measured in peripheral blood or bone marrow leukemia cells from 17 pretreated patients and 2

4、0 after combination chemotherapy by fluorometric assay. In the same time, multidrug resistant p-glycoprotein expression was detected by immunohistochemistry using JSB-1 monoclonal antibody and mdr-1 gene expression was assayed by RT-PCR in 18 post-chemotherapy patients. Results: Topo activities were

5、 significantly higher in pretreated AL patients (0.64150.0561) than in healthy blood donors (0.23040.0591)(P0.005) and significantly lower in post-chemotherapy patients (0.35630.1011) than in pretreated ones (P0.005). Among 15 poorly responsed patients, 12 were p170 positive and mdr-1 overexpression

6、, 3 case were p170 negative. Topo activity was also decreased in these poor responsers. Conclusion: Decreased Topo activity may be another factor in multidrug resistance.Key wordsLeukemia,acuteTopoisomerase Resistance,multidrug多药耐药(MDR)机制是肿瘤化疗的研究重点，其中较重要并研究得较深入的是mdr-1基因编码的p-糖蛋白过度表达及其逆转途径1，然而耐药产生是多因素

7、和复杂的，近几年来越来越多的资料表明DNA拓扑异构酶(Topo )的变化也是多药耐药的因素之一2。我们检测了急性白血病患者白血病细胞DNA Topo活性，mdr-1基因表达p170水平，研究其与化疗耐药关系，旨在探讨多药耐药机制，为治疗耐药白血病寻找新的线索。材料和方法1研究对象急性白血病为本院门诊及住院患者34例，经临床及骨髓细胞形态与细胞化学染色确诊。男22例，女12例，年龄1663岁，中位数35岁，其中急性非淋巴细胞白血病(ANLL) 20例、急性淋巴细胞白血病(ALL) 14例。正常对照组22名，男性14名，女性8名，年龄1643岁，中位数34岁，为本院献血员。2试剂JSB-单抗为美国

8、Signet Labortories产品；生物素-亲和素过氧化物酶复合物(ABC)试剂为美国Vector Labortories产品；mdr-1 RT-PCR试剂盒由北京京海生物工程公司提供；甲基磺酰氟(PMSF)，二硫苏糖醇(DTT)为华美生物工程公司产品。3方法3.1标本采集：取患者外周血810ml或骨髓34ml，健康人外周血6ml，肝素50U/ml抗凝，Hanks液稀释后，加入淋巴细胞分离液，离心，吸取单个核细胞层，1%冰醋酸溶解残余红细胞30秒，4 PBS洗涤3次，显微镜下计数，调整细胞至(25)106/ml。3.2Topo 活性检测3：采用低浓度溴乙锭荧光测定法，取上述部分悬液离心5

9、00r/min，10分钟，将离心沉淀细胞重新悬浮于细胞核缓冲液(A)中，调整细胞数21010/L，0放置15分钟，反复吹打混匀，再在裂解液中加入等量细胞核缓冲液(B)，轻轻混匀，置4提取。2小时后，于4 12000r/min离心20分钟，然后取上清液50l作微蛋白定量，并制作蛋白浓度标准曲线。酶反应管加入等量蛋白酶提取液，未反应管加相应体积缓冲液后于37反应30分钟，-20迅速冷却终止反应。反应混合液被稀释入2.0ml荧光检测液，设空白荧光检测液对照管。采用荧光分光光度计检测。计算酶活性，以反应后荧光减弱的比率表示。3.3p-糖蛋白检测4：用抗p-糖蛋白单抗JSB-1，以生物素-亲和素过氧化物

10、酶复合物(ABC)法检测，计数200个细胞，以阳性细胞大于10%作为阳性。3.4mdr-1检测：采用RT-PCR试剂盒法进行检测。总RNA提取：5106结果1急性白血病患者初治化疗前白血病细胞Topo活性17例患者初诊化疗前Topo 活性显著高于正常对照组(P0.005)(表1)。2急性白血病患者化疗后白血病细胞DNA Topo活性20例患者中复治17例，初治3例，均接受3个疗程以上化疗(HOAP、VDP、COMP、Vp16或ACR、THP及表阿霉素等)。化疗后组Topo 活性较化疗前组明显增高(P0.005)，化疗后组较正常对照组Topo 活性明显增高(P0.05 讨论化疗是目前治疗急性白血

11、病的主要手段，而耐药是治疗失败的重要原因，国内外学者研究已表明p170高表达是MDR的主要机制，同时也发现谷胱甘肽-S-转移酶，谷胱甘肽及谷胱甘肽过氧化物酶等细胞内解毒酶活性增加，使药物损害减低，也是MDR形成的重要原因之一。Topo 是调控DNA拓扑构象的酶，参与DNA复制、转录、重组等许多重要活动。Tadao等5报道，在肺癌与正常组织发现肺癌组织中Topo 活性较周围正常肺组织增高，这可能反映了肿瘤细胞的增殖特性。本研究结果也说明了治疗前患者Topo 活性明显增高，与原始及幼稚细胞升高及增殖细胞增多密切相关。本组患者化疗后18例检测p170/mdr-1基因表达，其中12例表达阳性，均为难治

12、与复发患者，6例表达阴性者中，3例呈完全缓解，p170/mdr-1检测结果与临床的符合率为83.3%。这说明p170/mdr-1基因高表达是MDR重要的耐药机制，但本组资料中3例临床疗效差患者，无p170/mdr-1基因表达，提示有p170/mdr-1以外的因素在耐药中起作用。Diffie等6报道阿霉素耐药的P388白血病细胞内，Topo 含量较敏感细胞降低76%。Ellen等7报道艾氏腹水(Ehrlich Acites)肿瘤细胞对柔红霉素耐药，发现MDR耐药表型存在p170高表达，并且从耐药细胞核中提取的Topo 活性比敏感细胞下降50%。说明Topo 活性与耐药有关，同时与p170高表达有

13、关，所以肿瘤细胞的耐药性在一定程度上与Topo 含量的下降有关。本组资料显示：急性白血病患者化疗后白血病细胞Topo 活性较化疗前明显降低，其中化疗后12例p170/mdr-1表达阳性者，均为难治与复发患者，而p170/mdr-1表达阴性者3例，临床疗效差而Topo 活性均减低。两组之间无明显差异。以上结果表明p170/mdr-1基因高表达是白血病多药耐药的重要机制，而白血病细胞Topo 活性减低，也与多药耐药有一定的关系，也可能与p170/mdr-1机制共同起作用。参 考 文 献1Chen CJ, Clark D, Ueda K, et al. Genomic organization of

14、 the human multidrug resistance (mdr1) gene and origin of P-glycoproteins. J Biol Chem, 1990, 265:506-514.2Paolo DL, Gapranico G, Binaschi M,et al. Evidence of DNA topoisomerase -dependent mechanisms of multidrug resistance in P388 leukemia cells. Mol Pharmacol, 1990, 37:11-16.3Andrea JE, Adachi K,

15、Morgan AR. Fluorometric assays for DNA topoisomerases and topoisomerasetargeted drug: quantitation of catalytic activity and DNA celeavage. Mol Pharmacol, 1991, 40:495-501.4谢兆霞. 抗MDR抗体检测白血病细胞P-糖蛋白. 湖南医科大学学报，1992， 17：63-64.5Tadao H, Lsobe KI, Nakashima I, et al. Higher expression of topoisomerase in lung cancers than normal lung tissues: different expression pattern from topoisomerase I. Biochem Biophys Res Commun, 1993, 195:409-414.6Diffie AM, Bosman DJ, Goldenberg GJ. Evidence for a mutant allele of the gene for DN