高血压、糖尿病大鼠的一氧化氮、内皮素变化与心肌病变的关系

1、    高血压、糖尿病大鼠的一氧化氮、内皮素变化 与心肌病变的关系        糖尿病和高血压时均有血管内皮功能障碍，一氧化氮(NO)与内皮素(ET)失调1，2。NO是重要的血管扩张因子，由NO合酶(NOS)催化L-精氨酸生成。我们研究目的在于建立SHR-糖尿病模型，观察高血压合并糖尿病时心肌内NO、ET系统的变化与心肌病变间的关系。一、材料与方法1实验动物：WKY和SHR大鼠 (46周龄)42只由中国医学科学院阜外医院提供。SHR大鼠随机分成SHR组和SHR-糖

2、尿病组。后者以链脲佐菌素75 mg/kg溶于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 4.3)中给予SHR大鼠腹腔内一次性注射。于第10周及20周分别取心血作生化检测，并分别取左心室肌置液氮内，用作NO及NOS活性测定；4%甲醛固定，石蜡包埋用作光镜检查及原位杂交；2.5%戊二醛固定做电镜检查。2检测方法：血压测定用RBP-1大鼠尾血压测量仪(我院临床医学研究所生理室研制)。血糖检测用葡萄糖氧化酶法。血浆ET测定采用解放军总医院东亚免疫技术研究所提供的ET放免测定试剂盒。（1）NO测定：将心肌组织块称重、剪碎，按50 mg组织加入含1%牛血清白蛋白的Kreb液，37恒温振荡水浴(95%O2-5%C

3、O2)持续平衡孵育90分钟，取孵育液0.1 ml，按Greiss法测终末产物NO2含量，换算为心肌组织释放的NO含量(nmol/g组织)。（2）NOS活性：按文献3方法分别测定内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS)活性，以每分钟pmol/mg.pr表示。（3）蛋白定量用考马斯亮蓝比色法。（4）原位杂交：石蜡切片厚3 m，脱蜡后，0.3% H2O2封闭，100 g/ml蛋白酶K消化，4%多聚甲醛后固定，乙醇脱水，风干。将加热(80，5 分钟)后的杂交液(含生物素标记的NOS-cRNA探针，北京医科大学病理系合成)加于玻片上(40 ng/片)杂交。42孵育1620小时。用2×

4、SSC甲酰胺溶液及2×SSC溶液(42)洗涤各20 分钟。1%马血清封闭，滴加1100ABC液，室温孵育1小时，DAB显色，苏木素复染。去离子甲酰胺、鲑精DNA、二巯基糖醇(DTT)及50%硫酸右旋苷购自美国公司。细胞胞质内棕色颗粒为杂交阳性，依杂交信号强弱分为0级。（5）光镜检查：切片3 m厚，做HE及Masson三重染色。（6）超微结构观察：组织块经Epon 812包埋，醋酸铀及枸橼酸铅染色，日本电子1200透射电镜观察。3统计学处理：实验结果以±s表示，多组资料用SYSTAT统计软件做方差分析。二、结果SHR组及SHR-糖尿病组血压显著高于WKY组，分别为（209.2

5、±24.8）、（162.0±18.6）及（102.5±9.4） mm Hg。SHR-糖尿病组血糖明显高于WKY组及SHR组，10周时分别为(20.8±2.5)、(7.4±1.2)及(9.7±2.1) mmol/L；20周时分别为(30.5±3.6)、(8.9±1.8)及(10.2±3.3) mmol/L (P<0.001)。血浆ET水平SHR组20周时高于其它两组(P<0.01)，分别为(147.0±33.0)、(95.0±17.0)、(88.0±17.0) pg

6、/ml。光镜观察，SHR-糖尿病组有明显的心肌间质纤维化，胶原纤维呈网状分隔心肌细胞(1)，心内膜下纤维组织增多，此外SHR-糖尿病及SHR组均可见冠脉周围纤维化，间质细胞增多。电镜下观察，SHR-糖尿病组心肌细胞内线粒体增多、肿胀、嵴减少且排列紊乱及空泡形成，心肌细胞水肿，肌纤维断裂，间质胶原纤维增多等。这些改变SHR-糖尿病组明显重于SHR组。 1SHR+糖尿病组20周，心肌间质胶原纤维增多Masson染色×100表1心肌NO及NOS活性测定(±s)组别NO(mmol/g)eNOSiNOS(每分钟pmol/mg.pr)i/c比值10周WKY450.5±162.

7、68.3±1.14.9±1.20.6±0.1SHR205.7±75.74.7±1.99.0±1.33.2±1.1SHR-糖尿病205.0±85.60.8±0.8*10.2±0.612.8±1.3*20周WKY497.7±70.38.2±1.74.0±0.80.5±0.1SHR329.6±100.54.4±1.99.4±1.42.3±0.8SHR-糖尿病247.5±85.01.0±0.4*

8、10.0±0.610.0±1.5*注：与WKY比P0.05，P0.01；与SHR相比*P0.05，*P0.012WKY组20周，正常心肌内冠脉NOS mRNA表达原位杂交×503SHR+糖尿病组20周，心肌内冠脉NOS mRNA表达4WDY组20周，正常心肌阻力血管NOS基因表达5SHR+糖尿病组20周，心肌阻力血管NOS基因表达6WKY组20周，正常心肌阻力血管ET mRNA表达7SHR+糖尿病组20周，心肌阻力血管ET mRNA表达(37均为原位杂交×100)三、讨论本研究成功地复制了链脲佐菌素-SHR-糖尿病模型，20周时心肌间质纤维形成网络状分隔

9、心肌细胞，其心肌细胞及线粒体的变化均提示心肌能量代谢明显障碍4，是糖尿病心肌病的病理基础。SHR组及SHR-糖尿病组心肌NO含量及eNOS活性减低，说明2组均有心肌血管内皮受损及功能障碍；高血压及糖尿病同时存在时内皮损害加剧。2组的iNOS活性均明显增高，SHR-糖尿病组心肌i/c比值明显高于SHR组，与其心肌病变程度相平行。由此看出，i/c比值较iNOS活性更能反映心肌病变程度，对评价心肌病变可能会更全面准确。SHR-糖尿病组在冠脉的内皮及平滑肌细胞NOS mRNA表达均下降，在阻力血管内皮NOS mRNA水平降低，而平滑肌细胞内表达无明显变化，说明心肌阻力血管内皮损伤后平滑肌产生的NO对血

10、管扩张起重要作用。两病变组心肌小血管ET mRNA表达增强，SHR组20周时血浆ET水平高于其它2组，说明ET水平增高与高血压直接相关。 本课题为国家教育部资助项目编号 教外司留（1996）644作者单位：100029 北京，中日友好医院内分泌科（郑旭、李光伟、陈任明、王瑶、杨文英），病理科（张晶、罗杰、王泰龄）参考文献1Rosen P, Ballhausen T, Stockklauser K. Impairment of endothelium dependent relaxation in the diabetic rat heart: mechanisms and implications. Diabetes Res Clin Pract, 1996, 31(Suppl):S143-S155.2Levin ER. Endothelins as cardiovascular peptides. Am J Nephrol, 1996, 16:246-251.3张新波，黄海鹭，张灵芝，等. 一氧化氮合成酶(NOS)活性的测定及其应用.北京医科大学学报,1994,26(增刊):173-176.4Tomita M, Muka