遗传性多发性外生骨疣基因突变研究

1、    遗传性多发性外生骨疣基因突变研究        【摘要】目的进一步阐明遗传性多发性外生骨疣(hereditary multiple exostoses,EXT)的发病机理，并为最终防治本病提供依据。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析，在30个EXT家系中进行EXT1基因和EXT2基因全部外显子突变检测，并对发现的致病突变进行DNA测序分析。结果在2个家系中发现了致病突变，并经DNA序列分析证实，一个系EXT1基因exon 6区域单个碱基(T)丢失；另一个系EXT

2、2基因exon 2区域4个碱基(tgtt)丢失，前者系国内首次报道，后者系尚未见报道的新突变，这两种突变均系移码突变。结论EXT1基因或EXT2基因突变，可导致EXT，本研究结果可直接应用于EXT的遗传咨询和产前基因诊断。【关键词】遗传性多发性外生骨疣聚合酶链反应-单链构象多态性分析基因突变 Identification of mutations in the human EXT1 and EXT2 genesSONG Guoqing*, ZHOU Jiangnan, XIA Jiahui, DENG Hanxiang, XU Lei, HUANG Lei, RUAN Qingguo.* Th

3、e Affiliated Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha, 410078 P.R.China. E-mail:wyxsgq.【Abstract】ObjectiveTo investigate further the genetic basis of hereditary multiple exostoses (EXT) and provide useful information for gene diagnosis of the disease. MethodsPolymerase chain reaction-sin

4、gle strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) was used to examine the entire coding regions of EXT1 gene on chromosome 8 and EXT2 gene on chromosome 11 for mutation in thirty EXT families. Mutations were further identified by sequencing. ResultsTwo frameshift mutations were identified in two unrela

5、ted EXT families. One was the deletion of one base(T) in exon 6 of the EXT1 gene, and the other was the deletion of four bases (tgtt) in exon 2 of the EXT2 gene. Both of the mutations resulted in a frameshift and premature termination of translation.ConclusionEXT is a genetically heterogeneous bone

6、disorder caused by the mutation of EXT tumor suppressor gene. These results could be directly applied in the genetic counselling and prenatal genetic diagnosis of EXT.【Key words】Hereditary multiple exostosesPolymerase chain reaction-single strand conformation polymorphismGene mutation遗传性多发性外生骨疣(here

7、ditary multiple exostoses,EXT)是一种具有遗传异质性的骨骼系统疾病，在基因组中至少存在3个位点，即8q24.1(EXT1)、11P11(EXT2)和19P(EXT3)1-3。由于在EXT并发软骨肉瘤的患者中观察到相关染色体的杂合性丢失，人们推测EXT基因是肿瘤抑制基因4。最近，EXT1基因和EXT2基因被克隆和鉴定5-7，为了进一步弄清EXT的发病机理，并为最终防治本病奠定基础，我们采用聚合酶链反应-单链构象多态性(poly-merase chain reaction-single strand conformation polymorphsim,PCR-SSCP)

8、分析银染技术，在30个EXT家系中开展EXT1基因和EXT2基因全部外显子的突变筛查，并对发现的致病突变行DNA测序分析。1材料和方法1.1EXT家系收集和DNA样品的制备30个EXT家系由湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室和附属第一、二、三医院共同收集，DNA提取按常规方法进行，并用紫外分光光度计定量。1.2PCR-SSCPPCR所用引物共24对(上海Sangon生物工程公司)，发现突变所用两对引物序列如下：引物P1 5-AGGTAAGGAGGGCGGAG-3，5-CCTCCAAATTCACTGCAG-3，扩增片段覆盖了EXT1基因exon 6。引物P2 5-CTATCGCTGTGG-CT

9、TCAACC-3，5-GGCTGTATGAGTGTGAGAT-3，扩增EXT2基因exon 2的一部分。PCR反应在PE480型PCR仪上进行，PCR反应总体积为20 l，含各引物0.5 mol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、Tris.Cl(pH8.3)10 mmol/L、KCl 50 mmol/L、MgCl2 1.5 mmol/L、明胶100 g/ml、Taq DNA聚合酶(Sangon公司)1U、基因组DNA 120ng。扩增条件为95预变性3分钟，随后941分钟、561分钟、721分钟，循环34周期。PCR结束后加入等体积加样缓冲液(含95%甲酰胺、20mmol/L EDTA、0

10、.05%溴酚蓝、0.05%二甲苯青)终止反应。6%中性聚丙烯酰胺凝胶检测扩增产物后，100变性10分钟，立即置入冰浴中，约10分钟后取12l混合液上样，行8%聚丙烯酰胺(291)凝胶(含5%甘油)电泳，电泳液为 1×TBE，电泳仪系Appligene公司生产V6-298型电泳系统，16恒温4W功率电泳20小时，卸胶银染方法参照文献报道8。1.3测序分析当SSCP分析出现异常单链构象带时则进一步做测序分析。用“压碎与浸泡”法，从6%聚丙烯酰胺凝胶中回收PCR产物，使用pGEM-T Vector System Kit(Promega公司)，将PCR产物连接于pGEM-T质粒载体，转化JM

11、109菌株，挑取白色克隆初级培养扩增后抽提质粒DNA，以质粒DNA为模板行PCR-SSCP检测，选择需要测序的克隆。将要测序的克隆次级培养扩增后，用Qiagen Plasimid Mini Kit(Qiagen公司)抽取质粒DNA制备测序模板，用Taq Dye Deoxy Termintor Cycle Sequencing Kit (ABI公司)进行测序反应，ABI377型DNA自动测序仪完成测序电泳和DNA序列分析。2结果用P1引物行PCR-SSCP，家系1的患者出现了一致的异常泳动移位的DNA单链构象带(1)。用P2引物行PCR-SSCP，则在家系2的患者中检出了一致的异常泳动移位的DN

12、A单链构象带(1)。进一步行DNA序列分析发现，家系1的患者发生了EXT1基因cDNA第2120位T的丢失(2，3)，位于exon 6，导致蛋白质变化FS L490，且在突变位点后第9个密码子处出现终止密码。cDNA序列分析为：正常序列2113ACCCCCCTGGTCTCTCAGTCCCAGCCAGTGTTGAAG488 TPLVSQSQPVLK突变序列2113ACCCCCCGGTCTCTCAGTCCCAGCCAGTGTTGA488 TPRSLSPSQC家系2的患者则在EXT2基因cDNA第789796位之间丢失4个碱基(tgtt)。第789796位之间原有2个tgtt，突变后丢失1个tgtt

13、，该突变位于exon 2。导致蛋白质变化FS V154。cDNA序列分析为：785 TGT CTG TTT GTT CCC TCC ATC GAT151 CLFVPSID785 TGT CTG TTC CCT CCA TCG ATG151 CLPPSM1EXT家系和SSCP电泳分析箭头指示的泳道出现异常泳动移位的ssDNA带，提示突变Fig 1EXT families and SSCP analysis The abnormal shifted ssDNA bands appear in the marked() lane indicating mutation2EXT1基因exon 6的一段

14、正常序列Fig 2A fragment of normal sequence in exon 6 of EXT1 gene3突变后的EXT1基因exon 6的一段序列(示T丢失部位)Fig 3A fragment of sequence after mutation in exon 6 of EXT1 geneThe arrow indicates the position of 1-bp deletion(T)3讨论1989年，Qrita等首先报道了PCR-SSCP分析技术，该方法为基因变异、尤其是为点突变的检测和筛查提供了可靠而简捷的手段。进一步的DNA序列分析则可明确突变的位置和类型。P

15、CR-SSCP分析的成功与否受到单链DNA长度、DNA变性条件、凝胶的浓度、交联度、温度、甘油含量以及电泳缓冲液浓度等因素的影响，据我们的经验，理想的SSCP条件有时需反复摸索，有的PCR产物即使采用多重SSCP，条件可能仍不理想，此时只能选用其它突变检测方法。最近，EXT1、EXT2基因相继被克隆。1995年，Ahn等5克隆了EXT1基因，此基因cDNA克隆编码区域长2238bp，与已知基因无明显同源性，同时，他们在2个EXT家系中检出移码突变，该突变存在于exon6，系cDNA第2120位T丢失。此突变改变阅读框，导致翻译在突变位点后第9个密码子处提前终止。以后，Wells等9又在另一家系

16、中检出此种突变，我们在中国人中也检出此突变，提示该部位突变发生率较高。1996年，Stickens和Deng等6，7克隆了EXT2基因。该基因cDNA克隆编码区域长2154bp，其核苷酸序列和所编码的氨基酸序列与EXT1基因有显著相似性。同时，他们在1个EXT家系中检出移码突变，该突变发生于exon2，系cDNA第784787位的4个碱基(ctgt)丢失。我们未发现此种突变，但却在exon2发现一种新的突变，该发现尚未见报道。我们报告的两种移码突变均导致翻译提前终止，所形成的蛋白质极有可能因快速降解失去活性，其肿瘤抑制功能丧失。随着EXT基因克隆，在EXT家系中开展基因突变检测，不仅有利于彻底

17、阐明EXT的发病机理，而且，其结果可直接应用于EXT的遗传咨询和产前基因诊断，并为最终治疗本病提供了依据。作者单位：宋国清周江南（410008 长沙，湖南医科大学附属湘雅医院）夏家辉邓汉湘徐磊黄蕾阮庆国（医学遗传学国家重点实验室）宋国清（现在湖南医科大学附属第三医院骨科）参考文献1Cook A, Raskind W, Blanton SH,et al. Genetic heterogenety in families with hereditary multiple exostoses. Am J Hum Genet, 1993, 5371-79.2Wu YQ, Heutink P, De V

18、ries BB, et al. Assignment of a second locus for multiple exostoses to the pericentromeric region of chromosome 11. Hum Mol Genet, 1994, 3167-171.3Le M, Legeai-Mallet L, Jeannin PM, et al. A gene for hereditary multiple exostoses maps to chromosome 19p. Hum Mol Genet, 1994, 3717-722.4Hecht J, Hogue

19、D, Strong LC, et al. Hereditary multiple exostoses and chondrosarcoma:linkage to chromosome 11 and loss of heterozygosity for EXT-linked markers on chromosomes 11 and 8.Am J Hum Genet, 1995, 561125-1131.5Ahn J, Ludecke HJ, Lindow S, et al. Cloning of the putative tumor suppressor gene for hereditary multiple exostoses (EXT1).