静注人免疫球蛋白细菌内毒素定量检测方法的探讨.docx

1、论著静注人免疫球蛋白细菌内毒素定量检测方法的探讨张璘，张继鹏，赵一欢，徐永浩，梁艳，刘晓，杨晓东，张安山，何彦林（兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州730046）摘要：目的探讨动态浊度法定最检测静注人免疫球蛋白细菌内毒素含量。方法参照中国药典20】0年版三部附录中细菌内毒素检查法的规定，对静注人免疫球蛋白细菌内毒素含鼠检测方法进行了探讨，制备了标准曲线、进行了可靠性试验和干扰试验,并将动态浊度法检测结果与家兔法的结果进行了比较。结果动态浊度法测定的标准曲线的相关系数均大于0.98,静注人免疫球蛋白经16倍稀释后,干扰试验的回收率在50%-200%之间，完全消除其对寅

2、试剂与细菌内毒素凝集反应的干扰.并且动态浊度法与家兔法的检测结果一致。结论动态浊度法定最测定静注人免疫球蛋白中细菌内毒素含危，结果准确，操作简单,并且与家兔检查热原的结果一致。关键词:静注人免疫球蛋白；动态浊度法;细菌内毒素中图分类号：Q81文献标志码：A文章编号：1005-5673（2013）02-0028-05InvestigationforquantitativedetectionofbacterialendotoxininintravenousimmunoglobulinZHANGLin,ZHANGJi-peng,ZHAOYi-huan,XUYong-hao,IJANGYan,UUXi

3、ao,YANGXiao-dong,ZHANGAn-shan,HEYan-lin(LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.Ltd,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,China)Abstract:ObjectiveTostudyonthedynamicturbiditymethodforquantitativedetectionofbacterialendotoxininintravenousimmunoglobulin(IVIG).MethodsAccording

4、totherequirementonquantitativedetectionofbacterialendotoxinofMPharmacopoeiaofthePeopleszRepublicofChina,SectionIII*,edition2010,thequantitativedetectionofbacterialendotoxininIVIGwascarriedoutbythedynamicturbiditymethod,thestandardcurve,reliabletestandinterferencetestwereperfomed.Thentheresultbetween

5、dynamicturbidityandtherabbitmethodwascompared.ResultsThecorrelationcoefficientinabsolutevalueofthestandardcurvefordynamicturbuditymethodisequaltoorhigherthan0.98(rNO.98).AftertheIVIGbeingdilutedinto16folds,recoveryofinterferencetestis80%to200%.Thismethodcompletelyeliminatestheinterferencebetweentach

6、ypleusamebocytelysateandbacterialendotoxin.Theresultfordynamicturbidityisidenticaltotherabbitmethod.ConclusionThistesthasadvantagiessuchasaccurate,sensitive,stable,goodrepeatability,anditsresultisconsistentwiththatoftherabbitpyrogentest.Keywords：IntravenousImmunoglobulin(IVIG);Dynamicturbiditymethod

7、;Bacterialendotoxin静注人免疫球蛋白（IVIG）是治疗原发性免疫缺乏症、继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病（川崎病、特发性血小板减少性紫瘢）的一种静脉注射用有效药物。细菌内毒素检查是静脉注射用制剂收稿日期:2012-12-06;修回日期：2013-02-19作者简介:张璘（1969-）,女，医学生物学工程师，主要从事血液制品的质量控制工作。通信作者：何彦林，E-mail：Hylin_lz刘晓，E-mail:boy-药物质量检查的一个重要方面。细菌内毒素检查是利用蚩试剂来检测或量化革兰阴性菌产生的内毒素，来判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。通常细菌内毒素检查方法

8、主要包括凝胶法和光度法，后者包括浊度法和显色基质法。中国药典2010年版三部（简称药典三部）中IVIG的热原检查中依然采用家兔法。家兔法检测热原是生物制品质量评价中的一项重要内容，但是家兔法不易标准化，不易定量，重现性和灵敏度均差。动态浊度法（动态比浊法）是通过测定凝胶形成过程中的浊度变化，由浊度变化和内毒素浓度间的定量关系来确定内逐素含量,具备灵敏度高，操作简便，快速的优点，该法已经用于疫苗及注射用抗生素等产品的检测。依据药典三部收载的细菌内毒素动态浊度法，对静注人免疫球蛋白半成品的细菌内毒素定量检测进行探索，并将其结果与家兔法检查热原的结果对比，为定量检测该制品细菌内毒素提供依据。1材料和

9、方法1.1材料和仪器细菌内毒素工作标准品购自中国食品药品检定研究院，批号：150601-201174；动态浊度法蚩试剂购自湛江安度斯生物有限公司，批号:0912032；鲨试剂购自湛江安度斯生物有限公司，批号：1206252；BET-72细菌内毒素测定仪购自天津市天大天发科技有限公司；试验家兔由兰州生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供；试管、吸头等其他试验用具均经250勾干烤30min以上去除热原。12静注人免疫球蛋白细菌内毒素限值（L）的确定根据药典三部细菌内毒素限值的确定按公式L=K/M计算。为供试品的细菌内毒素限值，以EU/mL表示;K为人每千克体重每h最大可接受的内毒素的剂量，以EU

10、/（kg-h）表示，注射剂K=5EU/（kgh）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg-h）表示，人均体重按60kg计算，静脉注射用人免疫球蛋白的细菌内毒素限值为0.5EU/mL。若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。1.3标准曲线的制备及可靠性试验用细萌内毒素检查用水1.0mL溶解细菌内毒素工作标准品，置涡旋混合器上混合30min,然后逐级稀释至最终内毒素为2.0、0.25、0.03125EU/mL3个浓度的稀释液，各取以上标准品液0.1mL分别加入预先加有0.1

11、mL鲨试剂的反应管内，混合均匀,用动态试管检测仪进行检测，其中每一浓度平行做3管，同时设平行2管作阴性对照。试验前先预热动态仪，使其达到反应温度（37±1）勾。进入动态仪系统软件，在软件给出的表格中填写反应项目及相应的参数:波K405nm,采集间隔时间10s,反应时间1h,达限值95%（反应液的透光度达到95%的时间）。反应结束后仪器自动显示出回归方程、相关系数、变异系数、实测值。14最大有效稀释倍数（MVD）的确定用以下公式来确定MVDMVD=cI/A,式中L为供试品的细菌内毒素限值0.5EU/mL；c为供试品溶液的浓度，当1，以EU/mL表示时，则c等于1.0mI/mL。人为动态

12、浊度法中标准曲线最低点的细菌内毒素浓度0.03125EU/mL。静脉注射用人免疫球蛋白的最大有效稀释倍数MVD为16倍。15供试品的配制用0.5mol/L的碳酸氢钠溶液调节供试品的pH至6.57.5。1.6干扰试验用一系列试管将5批IV1G用细菌内毒素检测注射用水稀释4、8、16倍备用。取非特异性彼试剂，每支加入细菌内毒素检测用水1250piL溶解。取动态浊度法专用光度测定管，每管加入细菌内毒素检测用水溶解的蜜试剂100jiL后加入稀释的供试液100J1L,细菌内毒素检测用100jiL，平行做2管作为阴性对照；加入稀释的供试品溶液与100|iL0.5EU/mL内毒素混合液，平行做2管作为阳性对

13、照;各管进行反应时间（7）测定，按标准曲线所得线性回归方程分别计算出阴性对照管和阳性对照管管内毒素浓度G和G,按下式计算该试验条件下的回收率（R）,无干扰浓度管为回收率在50%-200%的供试品。R=（G-）x100%1.7动态浊度法与家兔法比较抽取5批IVIG,分别采用动态浊度法和家兔法检测5批1V1G中的细菌内毒素，比较结果。然后抽取2批细菌内毒素合格的制品添加内毒素0.5EU/mL后，再用动态浊度法和家兔法进行检测，比较结果。2结果2.1标准曲线可靠性试验结果试验中，用内卷素检测用水将细菌内毒素工作标准品分别稀释成2。25和0.03125EU/mL,进行检测。表1结果显示,5次试验中，阴

14、性对照的反应时间均高于标准曲线最低浓度的反应时间。表2结果显示,5次试验的标准曲线的相关系数均大于上结果显示，动态浊度法标准曲线可靠，试验方法0.980表4结果显示,5次试验的准确度较高。以成立。表15次对照试验和内毒素标准试验的反应时间Tab.1Reactionlimeforcontrolandstandardendotoxintrialinfivetests内毒素含量(EU/mL)反应时间($)123450>4030>3940>3850>5120>403024755684875405350.25116812031054105115210.03125283626

15、33239422153459表25次试验测定的标准曲线和相关系数Tab.2Standardcurveandcorrelationcoefficientinfivetests次数标准曲线相关系数的绝对值标准1LgT=2.80473+(-0.44120Ig1NO.982LgT=2.86238+(-0.36297LgC)0.9995NO.9832T=2.80377+(-0.37089LgC)0.999730.984LgT=2.82178+(-0.34251LgC)0.9996>0.985LgT=2.86518+(-0.464671-gC)0.9995>0.982.2干扰试验结果试验中，将

16、IVIG分别稀释4、8、16倍，按照细菌内毒素干扰试验方案进行试验，图1展示的是作者20次试验的回收率的趋势分析情况。从图1中可以看出JV1G稀释16倍测定20次的回收率均在50%-200%,说明此稀释倍数对细菌内毒素检测无干扰。但是IVIG稀释8倍和4倍后测定25()的回收率均小于50%,不符合规定，说明8倍和4倍稀释对细菌内毒素测定有干扰。从表3结果中可以看出JVIG稀释16倍测定的回收率平均值也较高，符合相关规定。表4结果显示,5次试验的准确度较高。上述结果显示JVIG经16倍稀释后,采用动态浊度法测定制品中细菌内毒素的含量无干扰。H2(g(>05()*1钾MZ图120次试验测定不

17、同稀释度IVIG的回收率趋势情况Fig.1Trendanalysisofrecoveryratesin20testsfordifferentdilutionofIVIG表320次干扰试验回收率的平均值和标准差Tab.3Theaverageandstandarddeviationcfrecoveryratesin20inteferencetests项目稀释倍数1684平均值()84.534.834.5标准差(SD)19.795.3表45次试验测定的变异系数和实测值Tab.4Coefficientofvariationandmeasuredvalueinfivetests项目内毒素标准(EU/mL

18、)试验次数1234522.314.035.812.682.22变异系数(%)0.251.532.321.13.095.380.031254.933.092.884.335.6522.0241.92471.94461.93672.0799实测值(EU/mL)0.250.24410.270.26450.26660.23110.031250.03160.03010.03040.03030.03252.3动态浊度法与家兔法在检定IVIG中细菌内毒素的结果比较表5结果显示,0105的5批制品动态浊度法和家兔法检测细菌内毒素均合格,06和07的2批动态浊度法检测不合格，而家兔法检定也不合格，说明动态浊度法

19、和家兔法检测结果一致。表5动态浊度法和家兔法测定结果的比较Tab.5Thecomparisonofdynamicturbidityandtherabbitmethod供试品批号变异系数(%)回收率(%)实测值(EU/mL)家兔法升高温度(丁)家兔法判定结果010.8!910.06680.2,0.2,0.3合格02一88检测限0.2,0.2,0.4合格031.13980.01940,0.2,0.2合格04105检测限0.3,0.2,0.0合格05107检测限0.0,0.2,0.2合格061.131160.58010.7,0.8,0.5不合格070.761210.60710.5,0.9,0.8不合

20、格3讨论在中国的药品检验领域,用蚩试验法替代家兔法来检测产品中的细菌内毒素已经普遍和成熟。但目前所使用的方法多为凝胶限值法，其检验结果只能判断产品的内毒素含量是否超标，而无法给出准确的含量。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，可以相对准确地测定真实的内毒素含量，与传统的家兔检查法相比,具有检测灵敏度高、方便、准确、可定量等优点，避免了繁琐的操作，减少了污染的机会，具有更大的优越性。根据中国药典2010年版三部附录推荐的细菌内毒素检查方法，采用动态浊度法检测静注人免疫球蛋白中细菌内毒素含量°在试验中，确定了IVIG的最大稀释倍数为16倍，制备了标准

21、曲线,其相关系数N0.98,阴性对照的反应时间大于标准曲线中内隹素最低浓度的反应时间，说明标准曲线可靠，试验成立。动态浊度法检测内毒素是宿试剂在无干扰的条件下与内毒素的一种凝集反应，因此采用该法检SEIVIG的细菌内毒素含量，必须消除干扰。常用消除干扰的方法是稀释法、冷析法、化学法、溶剂抽提法、调节pH值法、超滤法等。本试验采用稀释法进行消除干扰,分别将IVIG稀释16、8和4倍进行干扰试验，图1和表3分析分别稀释3个倍数的IVIG20次试验的P1收率趋势情况，结果显示，IVIG稀释16倍测定20次的回收率均在50%200%，说明此稀释倍数对细菌内毒素检测无干扰，并旦20次试验的回收率平均值为

22、84.5%,说明干扰较小。IVIG稀释8倍和4倍后测定的回收率均小于50%,不符合规定，说明8倍和4倍稀释对细曲内毒素测定有干扰。结果显示JVIG经16倍稀释后，采用动态浊度法测定制品中细菌内毒素的含房无干扰。药典三部中对1VIG的热原检查依然采用家兔法，但是近年来，国内学者也成功建立了动态浊度法定量检测注射剂中细萌内毒素含量的方法。项庆军等采用动态浊度法定量检测静脉注射用人免疫球蛋白中细菌内毒素含量，检测结果准确、灵敏、稳定、重现性好，与家兔法检测结果相一致，结果显示鲨试剂动态浊度法能定屈检测静脉注射用人免疫球蛋白中细曲内毒素含量。卢文斌采用动态浊度法定量测定黄侬注射液中细菌内毒素的含咕，检测结果与凝胶法检测的结果有一定的相关性。刘肃等凶也建立注射用高纯度尿促性素中细菌内毒素定量检查的动态浊度法。因此本研究验证了动态浊度法