葛根素在共育体系中对成骨细胞增殖分化的影响(图文)

1、葛根素在共育体系中对成骨细胞增殖分化的影响(图文)    论文导读：药物葛根素广东省药品检验所批号:180752-200809。在共育体系中，成骨细胞在5100g/ml的葛根素中培养7d后产生促明显的增殖作用。其中以100g/ml促增殖作用最强。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志。 关键词：葛根素，成骨细胞，破骨细胞，增殖，分化    葛根素(Puerarin)是葛根中具有异黄酮结构的主要活性成分之一，有研究表明，葛根素具有预防骨质疏松的作用 1。本文观察了葛根素在成骨-破骨细胞共育体系中对大鼠成骨细胞增殖及碱性磷

2、酸酶活性的影响, 以评价其对骨代谢的作用。 1材料 1.1动物普通级1日龄Sprange-Dawley(SD)新生大鼠和5日龄SD新生大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：2008B006。 1.2药物葛根素 广东省药品检验所批号: 180752-200809。 1.3试剂DMEM培养基（GIBCO公司），0.25%胰蛋白酶(Amersco公司)，型胶原酶（Sigma公司），碱性磷酸酶试剂盒(Sigma公司)。 1.4仪器超净工作台(苏州净化设备厂产品)，倒置相差显微镜(Nikon产品)，CO2培养箱(ThermoForma公司产品)，细胞培养板(Costar公司产品)， 0.45m

3、过滤膜(Costar公司产品)，紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。论文格式。 2方法 2.1分离培养OB 参照文献2。 2.2分离培养OC 参照文献2。 2.3共育体系的建立 在已制作好并消毒的24孔共育培养板，以3×104个/孔的密度将OB接种到OB培养室内，以3×104个/孔的密度将OC接种到OC培养室内，每20min观察一次OC贴壁情况，同时观察是否有细胞透过半透膜进入OC培养室。 2.4MTT法测定葛根素对OB增殖的影响 取第三代OB以3×104个/孔的密度接种于OB 培养室，3h后，将新分离的OC以3×104个/孔接种于OC培养室；2

4、4h后换入无血清培养液，待细胞周期同步化后，更换为不同浓度的葛根素培养液。各剂量组的终浓度分别为0.05ug/ml、0.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml。每个浓度设6个复孔。分别培养7天，更换无血清的DMEM培养基400ul，同时加入5mg/mL的MTT80ul/孔，置37，5% CO2培养箱中孵育4h后，在酶标仪上测OD值，波长为570nm。参比波长为630nm。论文格式。 2.5PNPP法检测葛根素对OB ALP活性的影响 取第三代OB以5×104个/孔的密度接种于OB培养室，3h后，将新分离的OC以5×104个/孔接种于OC

5、培养室；待细胞周期同步化后，再分别加入0.5g/ml、5g/ml、50g/ml的葛根素，与空白组对照。培养7d后，加入500ul 0.1%TritonX-100作用30min, 收集细胞裂解液，采用ALP试剂盒检测其活性。 3结果 3.1葛根素对成骨细胞增殖的影响 在共育体系中，成骨细胞在5100g/ml的葛根素中培养7d后产生促明显的增殖作用。其中以100g/ml促增殖作用最强。而0.05g/ml、0.5g/ml的葛根素作用无明显差异。见表1。 表1不同浓度的葛根素对OB增殖的影响(X±S，n=6)      组别  &#

6、160; 空白组    0.05g/ml    0.5g/ml    5g/ml    10g/ml    50g/ml    100g/ml     OD值    0.256± 0.093    0.279 ±

7、;0.039    0.302± 0.021    0.326± 0.041*    0.338±0.029*    0.432±0.024*    0.572±0.030*     3.2葛根素对成骨细胞ALP活性的影响 碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志。在共育体系中，成骨细胞在不同浓度葛根素的培养下7d

8、，发现5g/ml、50g/ml浓度呈现明显的促分化作用，其它浓度作用无显著差异，见表2。 表2各实验组碱性磷酸酶活性测定（，n=6）      组别    空白组    0.5g/ml    5g/ml    50g/ml     ALP( 金氏单位)    1.541±0.142  &#

9、160; 2.664±0.453    3.241±0.581*    4.256±0.187*     4讨论 在正常生理条件下，骨组织中OB与OC间的功能活动并不是相互孤立存在的，骨组织的代谢依赖这两种细胞的相互作用；OB介导的骨形成与OC介导的骨吸收相互耦联，使骨重建处于一种动态平衡中，从而维持机体骨量与骨密度的正常。本实验研究注重OB和OC两者之间的相互作用，建立体外OB和OC联合培养体系以反应骨代谢的实际情况。 ALP是一种普

10、遍存在的细胞内酶，是OB功能及分化的早期指标之一。论文格式。ALP在细胞中的表达多少，可反映出OB的分化程度和功能状态，ALP活性越高，说明前OB向成熟的OB分化得越明显3。 本实验研究表明葛根素在共育体系中对大鼠OB有明显的促增殖作用。葛根素对OB ALP的影响随浓度增强而增强，表明葛根素能够促进OB合成和分泌ALP，提示葛根素可能通过促进OB的增殖和分化来增加OB的数量, 从而具有促进骨形成的作用。臧洪敏等4研究证实葛根素具有刺激OB增殖，提高ALP活性，与本实验结论相吻合。 本实验在细胞水平观察了葛根素对OB的直接作用，说明其预防骨质疏松的作用机制与其促进成骨细胞的增殖、分化的作用有关，为葛根素预防骨质疏松症提供了理论和实验依据。    参考文献 1王新祥,张允岭,吴坚,等. 葛根对骨质疏松模型小鼠骨密度和骨组织构造的作用J.中国骨质疏松杂志.2008，14(5):349-353. 2薛庆善主编. 体外培养的原理与技术. 北京：科学出版社，2001年第1版：4