飞蝗几丁质合成关键基因特性及转录调控研究报告

1、.飞蝗几丁质合成关键基因特性及转录调控研究【摘要】：几丁质是昆虫体壁和中肠围食膜的主要成分,几丁质合成是一个高度复杂的生化生理过程,受激素等信号途径的调控。由于高等动物不存在几丁质,因此昆虫几丁质合成途径是设计环境友好杀虫剂的理想靶标,具有重要的研究价值。本文以飞蝗(Locustamigratoria)为研究材料,对几丁质合成关键基因谷氨酸盐：果糖-6-磷酸转氨酶(LmGfat)、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(LmUAPs)和几丁质合成酶(LmCHSs)分子特性及转录调控进行了较为系统和深入的研究,主要内容如下：一、几丁质合成关键基因的mRNA表达特性分析利用qPCR技术分析了几丁质合成关

2、键基因在飞蝗不同组织和发育阶段的mRNA表达特性,结果表明：LmGfat、LmUAP1和LmCHSl在若虫体壁高表达,卵发育前期和后期及若虫蜕皮后表达量较高,龄期中间表达量较低；成虫期体壁低表达,LmGfat和LmUAP1在卵巢中恒定高表达,LmCHS1随着卵巢的发育表达量逐渐降低；LmUAP2和LmCHS2分别在脂肪体、中肠和胃盲囊中高表达,且在飞蝗整个发育期稳定表达；进一步的研究发现LmCHS2在中肠前、中、后段的表达量逐渐降低,原位杂交实验显示其转录本主要在胃盲囊柱状细胞形成的顶端区域中。几丁质合成关键基因mRNA表达特性不同,表明其生理功能的差异。二、几丁质合成关键基因的功能研究利用R

3、NA干扰技术进一步研究了几丁质合成关键基因的功能,结果表明：LmGfat、LmUAP1和LmCHS1负责体壁几丁质的合成；注射各个基因的dsRNA后,体壁切片的组织学观察表明,与对照组相比,新表皮几丁质合成量显著减少,导致飞蝗因蜕皮困难死亡；LmCHS2基因对中肠围食膜几丁质的合成起关键作用,注射dsCHS2组中肠围食膜不完整或完全缺失,影响食物的消化吸收从而使飞蝗因饥饿死亡。三、LmBR-C和LmE74基因的分子特性及功能分析Broad-plex和E74是蜕皮激素信号传导的早期应答基因,通过搜索飞蝗转录组数据库,获得6个BR-C和2个E74的同型异构体。以共同区域设计引物进行qPCR,结果表

4、明：LmBR-C和LmE74具有不同的组织分布和发育阶段表达特性,在肌肉和脂肪体中表达量最高,体壁中表达量也较高；这2个基因均在卵-若虫-成虫期表达,但呈现不同的表达特性。在四龄或五龄若虫期注射LmBR-C的dsRNA后,LmBR-C基因没有明显下调,而LmE74基因的表达则被显著沉默,但E74表达下调后并未影响飞蝗的生长发育,注射dsE74的飞蝗亦能成功羽化为成虫。四、LmEcR和LmRXR基因的分子特性及功能分析LmEcR和LmRXR在脂肪体、肌肉、体壁和前肠中高表达,卵发育后期及若虫蜕皮后表达量均较高。注射dsEcR或dsRXR均导致飞蝗高致死率,五龄第2天注射dsEcR组飞蝗发育时间延

5、迟,当对照组已完成正常蜕皮进入成虫时,处理组仍处于五龄若虫期,直至死亡。而注射dsRXR组飞蝗发育时间与对照组无明显差异,均因蜕皮困难死亡；切片的组织学观察显示,注射dsEcR组飞蝗旧表皮与皮细胞层没有分离,而注射dsRXR组飞蝗表皮与对照组相比无明显变化。五、几丁质合成关键基因的转录调控利用RNAi技术将LmEcR和LmRXR基因和早期转录因子LmE74的表达沉默后,并不影响几丁质合成关键基因(LmGfat、LmUAPl、LmCHSl和LmCHS2)的mRNA表达；解剖飞蝗体壁进行体外组织培养,加入20E后,几丁质合成关键基因的表达亦没有显著变化,表明几丁质合成关键基因不受20E的调控。研究

6、发现进食影响LmCHS2基因的表达,饥饿处理后LmCHS2基因在中肠中的表达被显著抑制,重新进食后,该基因的表达快速上调。基于上述结果推测几丁质合成关键基因的调控模式存在差异。六、氟虫脲处理飞蝗后差异表达基因的DGE分析氟虫脲浸渍法处理飞蝗后,试虫均在蜕皮时死亡,进一步利用数字基因表达谱(DigitalGeneExpression)分析氟虫脲处理前后差异表达的基因,结果显示：氟虫脲处理后差异表达基因主要集中在生物代谢,涉及蛋白、脂类、核酸、糖类等；部分几丁质酶、表皮蛋白及解毒酶系(羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和P450)基因在氟虫脲处理后也有显著变化。分析认为氟虫脲可能通过影响多个代谢通路的基

7、因而使飞蝗致死,这些变化基因的生物学功能和氟虫脲的潜在作用机理还有待进一步研究和探讨。【关键词】：飞蝗几丁质合成转录调控氟虫脲数字基因表达谱【学位授予单位】：XX大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q78【目录】：中文摘要12-14ABSTRACT14-17第一章前言17-371.昆虫的生长发育17-181.1昆虫变态发育的类型171.2昆虫的体壁与围食膜17-182.昆虫几丁质的结构及合成18-202.1几丁质的结构18-192.2几丁质的合成19-203.几丁质合成关键基因的研究现状20-253.1谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转胺酶研究概述20-213.2UDP-N-乙

8、酰葡糖胺焦磷酸化酶研究概述21-233.3几丁质合成酶研究概述23-254.昆虫生长发育的激素调控25-304.1蜕皮激素受体(EcR)与超气门蛋白(USP)26-274.2昆虫蜕皮的生理学过程27-294.3几丁质合成的激素调控29-305.害虫防治策略及指导思想30-335.1苯甲酰基脲类杀虫剂30-325.2RNAi在害虫防治中的应用32-336.本论文的选题依据33-347.研究内容及意义34-37第二章几丁质合成关键基因的mRNA表达特性37-531.实验材料37-381.1供试昆虫371.2供试药品及主要仪器37-382.实验方法38-412.1几丁质合成关键基因的表达38-402

9、.2LmCHS2基因的mRNA组织定位40-413.结果41-493.1几丁质合成关键基因在不同组织部位的表达分析41-453.2几丁质合成关键基因在不同发育阶段的表达分析45-494.讨论49-534.1几丁质合成关键基因的组织分布特点49-514.2几丁质合成关键基因的发育阶段表达特性51-53第三章几丁质合成关键基因的功能研究53-691.实验材料53-541.1供试昆虫531.2供试药品及主要仪器53-542.实验方法54-572.1dsRNA引物的设计542.2dsRNA的体外合成54-552.3dsRNA的注射552.4RNAi效果的检测及表型观察55-562.5表皮及中肠切片的组

10、织学观察56-573.结果57-653.1飞蝗谷氨酸盐：果糖-6-磷酸转氨酶基因(LmGfat)的功能分析573.2飞蝗UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因(LmUAP)的功能分析57-593.3飞蝗几丁质合成酶1基因(LmCHSl)的功能分析59-613.4飞蝗几丁质合成酶2基因(LmCHS2)的功能分析61-654.讨论65-694.1几丁质合成关键基因对飞蝗蜕皮的影响66-674.2几丁质合成关键基因对飞蝗进食的影响67-69第四章BR-C和E74基因的分子特性及功能研究69-851.实验材料69-701.1供试昆虫691.2供试药品及主要仪器69-702.实验方法70-722.1BR-

11、C和E74基因的序列搜索702.2BR-C和E74基因的cDNA序列分析702.3BR-C和E74基因的mRNA表达特性70-712.4BR-C和E74基因的功能分析71-723.结果72-803.1LmBR-C和LmE74基因的cDNA序列分析72-753.2LmBR-C和LmE74基因mRNA表达特性75-783.3LmBR-C和LmE74基因的功能分析78-804.讨论80-85第五章EcR和RXR基因的分子特性及功能研究85-1031.实验材料851.1供试昆虫851.2供试药品及主要仪器852.实验方法85-872.120E滴度的测定852.2EcR和RXR基因的cDNA序列分析85

12、-862.3EcR和RXR基因的mRNA表达特性86-872.420E对EcR和RXR基因表达的影响872.5EcR和RXR基因的功能分析873.结果87-993.120E滴度分析87-883.2LmEcR和LmRXR基因的cDNA序列分析88-903.3LmEcR和LmRXR基因的表达特性90-943.420E对LmEcR和LmRXR基因表达的影响94-953.5LmEcR和LmRXR基因的功能分析95-994.讨论99-103第六章几丁质合成关键基因的转录调控103-1131.实验材料1031.1供试昆虫1031.2供试药品及主要仪器1032.实验方法103-1042.1注射dsLmE74

13、对几丁质合成关键基因表达的影响1032.2注射dsLmEcR对几丁质合成关键基因表达的影响103-1042.3注射dsLmRXR对几丁质合成关键基因表达的影响1042.420E对几丁质合成关键基因表达的影响1042.5进食对几丁质合成酶2基因表达的影响1043.结果104-1103.1LmE74对几丁质合成关键基因的转录调控104-1053.2LmEcR对几丁质合成关键基因的转录调控105-1063.3LmRXR对几丁质合成关键基因的转录调控106-1073.420E对几丁质合成关键基因的转录调控107-1083.5进食对几丁质合成酶2基因的转录调控108-1104.讨论110-113第七章氟虫脲处理飞蝗后基因差异表达的DGE分析113-1231.供试药品1132.实验方法113-1142.1试虫处理1132.2样品收集113-1142.3RNA的提取1142.4SOLEXA/Illumina系统测序及DGE分析1143.结果114-1203.1