中科院_生物化学与分子生物学考博补充一

1、生物膜的运输机制？细胞膜物质转运的方式有单纯扩散，易化扩散，主动转运，出胞与入胞各自特点和机制为： 单纯扩散，脂溶性的小分子物质或离子从膜的高浓度侧移向低浓度一侧的现象称为单纯扩散。单纯扩散的特点是，不需膜蛋白质帮助，不消耗细胞自身代谢能量，顺浓度差进行，单 纯扩散转运的物质为脂溶性小分子物质易化扩散，指水溶性的小分子物质或离子在膜蛋白质的帮助下从膜的高浓度一侧移向低浓度一侧的转运方式。易化扩散的类型有载体转运。载体转运的特点有特异性，饱和性，竞争性抑制。载体转运转运的物质：主要是水溶性小分子有机物。主动转运，指在细胞膜上生物泵的作用下,通过细胞本身的耗能将物质从膜的低浓度一侧向高浓度的转运。

2、主动转运转运的物质主要是离子物质如钠，钾， 钙 。 特点是需要生物泵作用，消化细胞自身代谢能量，逆浓度差进行。出胞与入胞，大分子物质从细胞内移向细胞外称为出胞。大分子物质从细胞外移向细胞内称为入胞。出胞与入胞转运的物质为大分子物质。出胞与入胞的特点为需要细胞膜的运动，消耗细胞自身代谢能量。DNA 复制原理？DNA复制基本规律：复制过程为半保留方式；原核生物单点起始，真核生物多点起始，复制方向多为双向，也有单向；复制方式呈多样性，（直线型、Q型、滚动环型等）；新链合成需要引物 引物RNA长度一般为几个10个核甘酸，新链合成方向5'- 3',与模板 链反向,碱基互补；复制为半不连续

3、的,以解决复制过程中,两条不同极性的链同时延伸问题,即一条链可按5' - 3'方向连续合成称为前导链，另一条链先按5' - 3'方向合成许多 不连续的冈崎片段（原核生物一般长1000-2000个核苷酸,真核生物一般长100-200个核苷酸）,再通过连接酶连接成完整链, 称后随链,且前导链与后随链合成速度不完全致,前者快,后者慢. DNA 复制主要包括引发、延伸、终止三个阶段.DNA 的复制 是一个边解旋边复制的过程.复制开始时,DNA 分子首先利用细胞提供的能量,在解旋酶的作用下,把两条螺旋的双链解开,这个过程叫解旋.然后 ,以解开的每一段母链为模板 ,以周围环

4、境中的四种脱氧核苷酸为原料,按照碱基配对互补配对原则,在DNA 聚合酶的作用下,各自合成与母链互补的一段子链.随着解旋过程的进行,新合成的子链也不断地延伸,同时 ,每条子链与其母链盘绕成双螺旋结构,从而各形成一个新的DNA 分子 .这样,复制结束后 ,一个DNA 分子,通过细胞分裂分配到两个子细胞中去!免疫共沉淀与ChiSeq原理。什么是 ChIP?ChIP 的原理很简单：选择性富集包含某一特异性抗原的染色体（质）片段。能够识别某一蛋白或目的修饰蛋白的抗体被用来确定抗原在基因组中一处或多处的相对丰度。1、 分离总染色体（质） （需要通过交联使目的抗原固定在染色体（质） 与其结合的部位）。2、将

5、染色体（质）切割成片段（以提高精度）。3、对切成片段的染色体（质）进行免疫沉淀。4、免疫沉淀的染色体（质）片段进行分析，确定靶DNA 序列水平与其输入的染色体（质）的相对丰度。甲醛处理细胞-收集细胞，超声破碎-加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA 复合物相互结合 -加入 ProteinA， 结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物， 并沉淀-对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合-洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA 复合物 -解交联，纯化富集的DNA-片段-PCR分析。简述真核生物5 帽子结构和功能。m 是甲基，m7G 指 7-甲基鸟嘌呤核苷酸m7G 是所有 mRNA 的帽子都有结构，它跟 5&

6、#39;-PPPN 相连 （即 mRNA5' 端起始三磷酸核苷酸）。帽子结构通常有三种：m7GPPPN ， m7GPPPNm ， m7GPPPNmNm 。它们分别被称为O 型、I 型和 II 型mRNA的加工修饰包括：5 '端形成帽子结构、3'端轴lyA、剪接除去内含子和甲基化。在 5 -端加帽成熟的真核生物mRNA 的 5 -端有m7GPPPN 结构， 称为甲基鸟苷帽子。它是在RNA三磷酸酶，mRNA鸟音酰转移酶，mRNA （鸟喋吟-7）甲基转移酶和 mRNA （核苷 -2 ） 甲基转移酶催化形成的。甲基化程度不同可形成3 种类型的帽子：CAP 0 型、 CAP I型

7、和 CAP II 型。鸟苷以5 - 5焦磷酸键与初级转录本的5 -端相连。真核生物帽子结构的复杂程度与生物进化程度关系密切。5帽子的功能mRNA 5 -端帽子结构是mRNA 翻译起始的必要结构，对核糖体对mRNA的识别提供了信号，协助核糖体与mRNA 结合，使翻译从AUG 开始。帽子结构可增加 mRNA的稳定性，保护 mRNA免遭5' f3 '核酸外切酶的攻击。在蛋白质合成过程中，它有助于核糖体对mRNA 的识别和结合，使翻译得以正确起始。作用就有提高翻译强度。防止转录产物被核酸酶降解。可以促进蛋白质生物合成中起始复合物的形成。缺失后，无法起始翻译。有丝分裂及其调控（有丝分裂的

8、过程、变异及其调控前期（prophase） ：染色质逐渐凝缩变粗，起先是卷曲为一团乱麻，继而能分清各个染色体，且明显可以见到每条染色体都是由两条染色单体构成的，两条染色单体共用一个着丝点。核仁和核膜逐渐变得模糊不清。纺锤丝（spindle fiber）开始形成。中期（metaphase） ：核仁和核膜完全消失，纺锤体（spindle）明显可见。从细胞的侧面观察，各个染色体的着丝点均排列在纺锤体中央的赤道面上，而其两臂则自由地伸展在赤道面的两侧（图mitosis-metaphase-cemianguan）此时，染色体具有典型的形状，适于观察和记数 （图2-8-1）。后期（anaphase） ：每

9、个染色体的着丝粒分裂为二，每条染色体的两条染色单体各自分开而成为两条独立的染色体， 并在纺锤丝的牵引下分别移向两极。移向两极的染色体数目是完全一样的，且同分裂前母细胞的染色体数目、形态完全一样（图 mitosis-anaphase。）末期 （ telophase） ： 染色体已移至两极（图 mitosis-telophase）， 围绕者染色体重新出现核仁核膜，染色体又重新变得松散细长，回复为染色质的状态。至此，一个母细胞内形成了两个子核。接着在纺锤体的赤道板区域形成细胞板，细胞质被分隔开,一个母细胞分裂为两个完全相同的子细胞。继而，子细胞又进入G1 期。以哺乳动物精子和卵子发生为例。简述减数分

10、裂精子减数分裂时,初级精母细胞DNA 复制一次,然后进行一次分裂（即减数第一次分裂）形成两个次级精母细胞,每个次级精母细胞再进行一次分裂（减数第二次分裂）,共形成四个精子卵细胞减数分裂时,初级卵母细胞DNA 复制一次,然后进行一次分裂（即减数第一次分裂）形成两个大小不等的细胞,大的称之为次级卵母细胞,小得称之为第一极体.次级卵母细胞再分裂一次,再次形成两个大小不等的细胞,大的即卵细胞,小的称为第二极体.相同点：都是 DNA 复制一次而进行两次分裂；都在减数第一次分裂发生同源染色体的配对以及同源染色体的分开；都在减数第二次分裂发生姐妹染色单体的分离；分裂后细胞内的染色体数都减半.不同点： 初级精

11、母细胞减数分裂的结果是形成四个精子而初级卵母细胞减数分裂的结果是形成一个卵细胞、一个第一极体和一个第二极体.试述细胞膜的化学组成流动镶嵌模型模型认：细胞膜结构是由液态的脂类双分子层中镶嵌可以移动的球形蛋白质而形成的.随着科学研究技术的不断创新和改进,流动镶嵌模型也逐步得到完善,是目前比较公认的膜结构模型.这一模型强调两点：膜的流动性，膜蛋白和膜脂均可侧向移动.膜蛋白分布的不对称性,球形蛋白质有的镶嵌在膜的内或外表面,有的嵌人或横跨脂双分子层.膜的流动性是细胞膜结构的基本特征之一,同时也是细胞膜表现其正常功能的必要条件.膜的流动性是指膜结构分子的运动性,它包括膜脂的运动和膜蛋白的运动.膜脂的流动

12、性膜脂的运动在正常生理状况下,膜脂分子处于运动状态.膜脂的运动方式主要有侧向扩散、旋转运动、旋转异构运动、左右摆动以及翻转运动等.细胞膜中的蛋白质也能以侧向扩散等方式运动.人们通过实验已充分证实了膜蛋白的流动性.膜蛋白主要有以下几种运动形式： 随机移动有些蛋白质能够在整个膜上随机移动.移动的速率比用人工脂双层测得的要低 .定向移动有些蛋白比较特别,在膜中作定向移动.例如,有些膜蛋白在膜上可以从细胞的头部移向尾部. 局部扩散有些蛋白虽然能够在膜上自由扩散,但只能在局部范围内扩散其主要特点是：细胞膜不是静态的,而是膜中的脂质和蛋白质都能自由运动.即是：磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架,蛋白质分子贯

13、穿在磷脂双分子层中或覆盖有磷双分子层表面.由于磷脂双分子层可以运动、蛋白质分子可以运动,所以整个膜是可流动的。给你一个新基因，如何研究它的功能基因功能的研究思路主要包括:1 .基因的亚细胞定位和时空（发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官）表达谱;2 .基因在转录水平的调控（可以通过genome walking PCR 或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP 等技术,寻找该基因的转录调控蛋白）3 .细胞生化水平的功能研究（也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交 ,GST pulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc 等等,对该

14、基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位 ）4 .gain-of-function & loss-of-function: 也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown（或knockout）,从表型分析该基因的功能 .功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.关于基因的表达和定位,可以这样去做：1 .mRNA 水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素 ），提取RNA,反转录，做RT-PCR或real time RT-PCR,检测基因的表达情况/变化 .（或者以northern blot、Rnase pr

15、otection assa昉法,检测基因的 mRNA表达情况/变化.）2 .蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Western blot、免疫组化（OR免疫荧光 ）检测目的蛋白的表达.3 .检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如 GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达,在活细胞中观察蛋白的细胞定位.DNA 重组的意义简述 RNA 剪接和蛋白质剪接RNA 剪接：将转录初始物中的内含子切除,紧接着将其编码多肽链的外显子连接在一起的过程.RNA 剪接方式：1 .一类内含子的自我剪接；2 .二类内含子的自我剪接；3 .核内mRNA 剪接体剪接；4 .核内前体tRNA 酶

16、促反应剪接.前两类内含子的剪接方式都是两次转酯反应,区别就是第一次转酯反应所用亲核试剂不同；第三类剪接方式分为组成性剪接与选择性剪接，前者识别5 '-GU AG3'内含子序列,而后包括可变poly A 位点和可变剪接方式；第四类需核酸酶及连接酶等工具酶,形成成熟 tRNA.蛋白质剪接是蛋白质内含肽介导的,一种在蛋白质水平上翻译后的加工过程,它由一系列分子内的剪切一连接反应组成.蛋白质内含肽是一个蛋白质前体中的多肽序列,可以催化自身从蛋白质前体中断裂,使两侧的蛋白质外显肽连接成成熟的蛋白质.蛋白质内含肽的发现不仅丰富了遗传信息翻译后加工的理论, 在实践中也有广泛的应用前景.蛋白质

17、相互作用什么是反义RNA?真核生物中反义RNA调节基因表达的机理是什么 ？反义 RNA（antisense RNA） 是一类自身没有编码功能，但能通过配对碱基间氢键与目的RNA 特别是 mRNA 的特定区域补结合，从而抑制基因表达的小分子RNA。 一般将自然存在或人工合成的反义 RNA,通过基因重组反向插入到表达载体，以此转染细胞、在细胞内产生大量反义RNA。其作用机理包括：1）与引物RNA结合或作用于引 物前体，阻止引物与DNA 结合，抑制DNA 复制； 2）在转录水平或转录后加工过程中，阻止特定基因转录，或与mRNA 5'端结合，阻止加帽过程；或与剪接位点结合，阻止mRNA 的剪接

18、形成等；3）与 SD序列或编码区关键点如AUG 结合，阻止mRNA 与核糖体结合，阻断翻译等。反义 RNA 是指与目标RNA 具有互补序列的RNA 分子。反义RNA 通过序列互补与特定的mRNA结合，从而抑制 mRNA的翻译。考点反义RNA。由于通过反义 RNA与正链 RNA形成双链RNA,可特异性地抑制靶基因；通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列 的双链RNA（有义RNA和反义 RNA）,可诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。因此，反义RNA 的发现，为人为精细调控基因的表达提供了一条新的途径。设计PCR 引物考量指标：主要是这么几点注意的：1、引物长度一般为 15-30

19、bp,常用的为18-27bp,但不能大于38bp；2、引物GC 含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC 含量和 Tm 值要保持接近；3、引物所对应的模板序列的Tm 值最好在72左右，至少要在 55-80之间， Tm 值曲线以选取 72 度附近为佳，5'到 3 的下降形状也有利于引物与模板的结合；4、AG值（自由能）反应了引物与*II板结合的强弱程度，3'端的AG值相对要低，且绝对值不要超过9,否则不利于正确引发反应， 3'末端双链的 AG值在0-2kcal/mol时，PCR产量 几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%， -8 时少于20%， -1

20、0时接近于0；5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；6、 Frq 曲线为 Oligo6 软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq 值相对较低的片段；7、 引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5， 否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR 不能正常发生；8、 3'端最好不要是连续碱基，GGG 或 CCC

21、会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T,若是，会导致错配；9、以公式Tm=4* （ G+C ） +2*（ A+T ） -5计算 Tm 值，也就是退火温度。选择较低Tm 值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm 值相匹配，且在70-75范围内；10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm 的差异越小，PCR 的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp,选用端白引物（16-18bp）,如果产物长5kb,则用24bp的引物；11、 在 DNA 测序和 PCR 中最好用5'末端稳定（GC 含量多） ，而3'端不

22、稳定（AT 含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；12、引物和产物之间的Tm 值相差别太大，20 摄氏度范围内最好。13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。表观遗传，及调控方式，还有蛋白质通过哪些共价修饰调控其功能？表观遗传（epigeneticS）是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。表观遗传改变从以下3 个层面上调控基因的表达，DNA 修饰： DNA 共价结合一个修饰基团，使具有相同序列的等

23、位基因处于不同的修饰状态；蛋白修饰：通过对特殊蛋白修饰或改变蛋白的构象实现对基因表达的调控；非编码 RNA 的调控：RNA 可通过某些机制实现对基因转录的调控以及对基因转录后的调控，如RNA 干扰 （RNA interference,RNAi） 。1）磷酸化：主要发生在 Ser,Thr和Tyr等三种氨基酸侧链。由各种蛋白激酶催化。2）甲基化：由N-甲基转移酶催化蛋白质的甲基化，甲基供体是5-腺昔蛋氨酸。该甲基转移主要存在于细胞质内。甲基化位点主要在 Arg, His和GIn的侧基的N-甲基化以及 Glu和Asp 侧基的。-甲基化。3）乙酰化：N-乙酰基转移酶多肽链的 N端乙酰化。有两组乙酰转移

24、酶，都以乙酰 -CoA为酰基供体，一组为分泌非蛋白的乙酰转移酶。4）腺苷酸化:将腺苷酸基团AMP 转移到蛋白质的Thr 残基的侧链-OH 基上，使之发生腺苷酸化。5）糖基化：糖基化是真核生物细胞蛋白质特征之一。进入内质网膜或腔的蛋白质都被结合寡糖基团而糖基化。糖基化由ER 中的糖基化酶催化，极少数蛋白质能在胞质中被糖基化。糖基化类型：寡糖基团连接在 Asn侧链上的-NH2上，形成N-糖昔键连接；寡糖基团与Ser,Thr的-OH基团连接，形成 O-糖昔键连接。2、蛋白质与DNA 结合的方法和比较，EMSA 和 DNase1 足迹法？螺旋-转角-螺旋：螺旋一转角一螺旋（helix-turn-hel

25、ix）是最初在 入噬菌体的阻遏蛋白中发现的一种DNA结合结构域。在阻遏蛋白氨基端有5段“螺旋，每段螺旋之间折转成一定角度相连接，其中两段负责同DNA 结合（图 7： 6）。 。 螺旋 3 由 9 个氨基酸组成，与前面的由7个氨基酸组成的。螺旋2形成一个角度。a螺旋3通过氨基酸侧链同 DNA碱基之间的氢键同DNA序列相结合，3个氨基酸识别3个碱基，所以a螺旋3被称为识别螺旋（recognition helix）。a螺旋2则是通过氢键同 DNA的磷酸骨架相接触。这种相互作用对于同DNA结合是必需的，但并不控制对靶序列识别的专一性。锌指结构：锌指（zinc finger） ：一种常出现在DNA 结合蛋白中的一种结构基元。是由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn2+构成，形成的结构像手指状。锌指结构指的是在很多蛋白中存在的一类具有指状结构的结构域，这些具有锌指结构的蛋白大多都是与基因表达的调控有关的功能蛋白。锌指结构的共同特征是通过肽链中氨基酸残基的特征集团与Zn2+ 的结合来稳定一种很短的，可自我折叠成“手指”形状的的多肽空间构型。亮氨酸拉链：leucine zipper 一种蛋白质中常见的结构模体，由一组（通常是45个）重复片段组成， 每个重复片段的第7 个氨基酸残基均为亮氨酸，两条含有此模体的多肽链可形成