第六章 细菌对抗菌药物的敏感试验

1、第六章 细菌对抗菌药物的敏感与耐药性一种抗菌药物如以很小剂量便可抑制、杀灭细菌，则称该细菌对该抗菌药物具有敏感性。细菌的耐药性是指细菌对于抗菌药物不敏感，具有耐受性。抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。抗生素是真菌、放线菌、细菌等的代谢产物。化学合成药物是经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物。第一节 临床常用抗菌药物抗菌药物-内酰胺类青霉素类天然青霉素青霉素G、青霉素V耐青霉素酶青霉素甲氧、苯唑、氟氯西林广谱青霉素氨基组氨苄西林、阿莫西林羧基组替卡西林、羧苄西林脲基组美洛、阿洛、派拉西林头孢菌素类碳青霉烯类亚胺、美洛、帕尼培南头霉素类头孢西丁、头孢替坦单环内酰胺类氨曲南、卡

2、芦莫南氧头孢烯类拉氧头孢、氟氧头孢内酰胺类抑制剂克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦氨基糖苷类卡那、妥布、新、庆大霉素、米星、卡星喹诺酮类沙星大环内酯类红、吉他、麦迪、乙酰螺旋霉素糖肽类万古、替考拉宁、多粘、杆菌肽磺胺类四环素类土、四环、多西、米诺氯霉素类林可霉素类林可、克林合成抗菌药硝基呋喃、硝基咪唑、链阳霉素、恶唑烷酮-内酰胺类抗生素青霉素类头孢菌素类碳青霉烯类头霉素类单环内酰胺类氧头孢烯类内酰胺类抑制剂（一）-内酰胺类抗生素-内酰胺类抗生素系指化学结构中具有-内酰胺环的一大类抗生素，是现有的抗生素中使用最广泛的一类。各种-内酰胺类抗生素作用相似，通达抑制细菌细胞壁合成而发挥抑菌和杀菌作用-内酰胺类

3、抗生素与细胞壁上的青霉素结合蛋白（PBP）结合，阻碍肽聚糖合成，致细菌不能合成完整的细胞壁，导致细菌死亡。该过程发生在细菌细胞繁殖期，本类药物为繁殖期杀菌药。青霉素结合蛋白（PBPs）细菌细胞壁合成是通过下面几种酶催化完成。转糖基酶，转肽酶D-羧肽酶内肽酶，青霉素和-内酰胺类抗生素与青霉素结合蛋白结合，抑制上述酶从而抑制细菌细胞壁合成。PBPs2.头孢菌素类头孢菌素类抗生素是一簇广谱半合成抗生素。头孢菌素分类方法是根据发现的先后和抗菌作用将其命名为第一代、第二代、第三代、第四代头孢菌素。第一代头孢菌素有头孢噻啶、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢匹林、头孢羟氨苄。第二代头孢菌素有头孢

4、孟多、头孢呋辛、头孢尼西、头孢雷特、头孢克洛、头孢丙烯、氯碳头孢。第三代头孢菌素有头孢哌酮（先锋必）、头孢三嗪（菌必治）头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑肟、头孢克肟、头孢布烯、头孢地尼、头孢泊肟。笫四代头孢菌素有头孢匹罗、头孢吡肟。抗菌效果：革兰阳性球菌：一代头孢菌素二代头孢菌素三代头孢菌素；革兰阴性杆菌：一代头孢菌素二代头孢菌素舒巴坦、他唑巴坦；ESBLs抑制能力：三唑巴坦克拉维酸、舒巴坦4.复合制剂种类加酶抑制剂的复合制剂用于产内酰胺酶的革兰阴性和阳性细菌。包括：氨苄西林-舒巴坦替卡西林-克拉维酸阿莫西林-克拉维酸派拉西林-三唑巴坦头孢哌酮-舒巴坦AmpC 酶是AmpC 内酰胺酶的简称

5、。 是由肠杆菌科细菌或和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类内酰胺酶，作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的内酰胺酶。故AmpC 酶又称作为头孢菌素酶。（二）氨基糖苷类按其来源分为：由链霉菌属发酵滤液提取获得，有链霉素、妥布霉索、核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；由小单胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、阿司米星；半合成氨基搪苷类，有阿米卡星、奈替米星、地贝卡星等。氨基糖苷类抗生素对需氧革兰阴性杆菌有强大的抗菌活性，如大肠、克雷伯、肠杆菌属、变形、志贺；对沙雷菌属、气单胞菌属、产碱杆菌、卡他莫拉菌、不动杆菌属、沙门菌属、分枝杆菌属也有一定的活性。对革兰阴性球菌如淋病奈瑟菌等效果差。对阳性球菌有一定

6、的活性，对肠球菌单独用药无作用。庆大霉素、妥布霉素、奈替米星以及阿米卡星是目前常用的四种氨基糖苷类抗菌药物。氨基甙类氨基甙类杀菌剂，抑制菌体蛋白质；对抗阴性杆菌灵，链卡还治结核病；耳肾毒性最严重，控制剂量定慎用。氨基糖苷类抗菌药物作用机制为：依靠离子的吸附作用，吸附在菌体表面，造成膜的损伤；和细菌核糖体30s小亚基发生不可逆结合，抑制mRNA 的转录和蛋白质的合成，造成遗传密码的错读，产生无意义的蛋白质。链霉素链霉素，易抗药，迅速持久程度高。一般感染已少用，配伍用药增疗效。联 合 异 烟 肼，治 疗 结 核 病；配合青霉素，心内膜炎停；合用四环素，治疗布氏病；伍用SD， 鼠疫兔热病。（三）喹诺

7、酮类第一代喹诺酮类为窄谱抗生素，对革兰阳性球菌无作用，主要作用于大肠埃希菌，且迅速出现耐药，已较少应用于临床，有新恶酸、奈啶酸和恶喹酸。第二代喹诺酮类为广谱类抗生素，对革兰阴性和阳性细菌均有作用，比较这类药的抗菌活性强度依次为环丙沙星、氧氟沙星、罗美沙星、氟罗沙星、培氟沙星、诺氟沙星。第三代喹诺酮类为超广谱类抗生素，对革兰阳性菌作用高于第二代的48倍，对耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）、多重耐药肺炎链球菌（PRSP）和肠球菌优于第二代，对厌氧菌均有作用，有司帕沙星、妥舒沙星、左氧氟沙星、加替沙星、格帕沙星、莫西沙星等。奎诺酮类作用机制是：通过外膜孔蛋白和磷脂渗透进人细菌细胞；作用DNA旋转酶，干扰

8、细菌DNA复制、修复和重组。（四）大环内酯类目前国内常用的有红霉素、吉他霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素。抗菌谱和青霉素相仿，主要是革兰阳性菌，对流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌、淋病奈瑟菌等也敏感，对除脆弱类杆菌、梭杆菌属外的各类厌氧菌也具有强大的抗菌活性，对某些螺旋体、肺炎支原体、非结核分枝杆菌、立克次体、衣原体等有抑制作用。新一代大环内酯类有克拉霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉素、阿奇霉素、罗他霉素和美欧卡霉素。和红霉素相比，抗菌谱扩大，抗菌活性增强。对流感嗜血杆菌、军团菌、支原体、衣原体等具有强大抗菌作用。红霉素大环内酯红霉素，碱性环境增效果；青红合用不对路，盐析现象须记住，林红竞争结合点，四红合

9、用增肝毒。其作用特点和机制是：可逆结合细菌核糖体50s大亚基的23s单位，抑制肽酰基转移酶，影响核蛋白位移，抑制细菌蛋白质合成和肽链延伸；肺部浓度较血清浓度高；新一代大环内酯类具有免疫调节功能，能增强单核-吞噬细胞吞噬功能。（五）糖肽类有多黏菌素、杆菌肽、万古霉素、替考拉宁。万古霉素和替卡拉宁对革兰阳性球菌具有强大的活性，对MRS非常敏感，多黏菌素B和E为对革兰阴性菌有强大的抗菌作用，对各类阳性菌均无作用。作用机制能与一个或多个肽聚糖合成中间产物D-丙氨酰-D-丙氨酸末端形成复合物，阻断肽聚糖合成的转糖基酶、转肽基酶和D-D羧肽酶作用，从而阻止细胞壁合成。（六）磺胺类磺胺类分成三类：口服吸收好

10、，用于全身感染的药物，按清除速度又分为短效、中效、长效三类，有磺胺甲基异恶唑（SMZ）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺林（SMPZ）口服吸收差，主要在肠道起作用的药物，柳氮磺嘧啶银（SD-Ag）、磺胺二甲氧嘧啶主要用作局部应用的药物，磺胺米隆（SML）、磺胺醋酰钠（SD-Na）。对革兰阳性菌和革兰阴性菌有抗菌作用，对肺孢子虫、弓形虫滋养体有作用，局部用药用于创面和眼科。和甲氧苄啶组成复合制剂抗菌活性增加数十倍，抗菌范围也扩大，由抑菌作用变为杀菌作用。其作用机制是竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止氨基苯甲酸与二氢叶酸合成酶的结合，使细菌体内核酸合成的重要物质辅酶F钝化而导致细菌生长受到抑制。磺胺类抗菌谱

11、二菌一体和一虫，外加结核与麻风。说明：二菌指细菌和放线菌，一体指衣原体，一虫指疟原虫。（七）四环素类四环素分为短效、中效和长效短效四环素有：土霉素、四环素；中效四环素有：地美环素、美他环素；长效四环素有：多西环素、米诺环素。四环素为广谱抗生素，包括对革兰阳性菌和阴性菌，如部分葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌等有一定的抗菌作用，对立克次体、支原体、螺旋体、阿米巴等敏感。作用机制主要与细菌的30s核糖体亚单位结合，阻止氨酰基转移RNA与mRNA核糖体的受位位点结合，阻止肽链延伸，抑制蛋白质合成。四环素类抗生素抗菌活性的顺序为：米诺环素多西环素美他环素地美环素。临床上常作为衣原体、立克次体感

12、染的首选药物。四环素抗菌谱二菌四体一虫灵，基本无效伤绿结。说明：二菌指细菌和放线菌，四体指立克次体、支原体、衣原体、螺旋体，一虫指阿米巴原虫。（八）氯霉素类氯霉素类抗生素包括氯霉素、甲砜霉素。其作用机制为作用细菌70s核糖体的50s亚基，使肽链延长受阻而抑制蛋白合成。该类抗生素脂溶性强，易进人脑脊液和脑组织。由于人和哺乳动物线粒体也含有70s核糖体，因而氯霉素可抑制宿主线粒体蛋白合成，可引起与剂量相关的骨髓抑制和灰婴综合征。（九）林可霉素类林可酰胺类包括盐酸林可霉素、克林霉素。主要作用于革兰阳性球菌和白喉棒状杆菌、破伤风梭菌等革兰阳性杆菌。各种厌氧菌，特别对红霉素耐药的脆弱类杆菌对该药敏感。其

13、作用机制是与细菌50s核蛋白体亚基结合，抑制蛋白质合成，并可干扰肽酸基的转移，阻止肽链的延长。沙眼衣原体对本类抗生素敏感。克林霉素是治疗肺部厌氧菌感染、衣原体性传播性疾病的首选药物。（十）合成的抗菌药物1.硝基呋喃类呋喃妥因和呋喃唑酮对革兰阳性球菌和部分革兰阴性杆菌具有较强抑菌和杀菌作用作用机制是干扰细菌体内氧化还原酶系统，阻断细菌代谢，产生抑菌、杀菌作用。本类药品口服吸收后在体内很快被代谢灭活，不适于治疗全身感染而用于肠道、尿路感染和外用消毒。2.硝基咪唑类甲硝唑、替硝唑对厌氧菌有抗菌作用，对需氧菌无效。其作用机制是硝基环被厌氧菌还原而阻断细菌DNA合成，阻止DNA的转录、复制，导致细菌死亡

14、。替硝唑还能够穿透细胞膜，快速进人细菌体内。甲硝唑甲硝唑药作用灵,原虫滴虫厌氧菌。肠内肠外阿米巴,效果良好首选它。3.链阳霉素类奎奴普汀、达福普汀用于由多重耐药的革兰阳性菌引起的严重感染，尤其是医院获得性感染。特点：对MRSA感染的有效率可达90%以上，对万古霉素治疗无效的屎肠球菌感染有效率达67%。4.恶唑烷酮类利奈唑胺对甲氧西林敏感或耐药的葡萄球菌、万古霉素敏感或耐药肠球菌、青霉素敏感或耐药肺炎链球菌均显示良好的抗菌作用，对厌氧菌也有抗菌活性一、青霉素类青霉素G、耐青霉素酶青霉素、广谱青霉素等 二、头孢菌素类包括第一代、第二代、第三代头胞菌素。 三、其他内酰胺类1.单环内酰胺类抗生素，氨曲

15、南和卡芦莫南等 2.头霉素类和氧头孢烯类，头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑。3.碳青霉烯类，亚胺培南、米洛培南、必安培南、帕尼培南。4.内酰胺类抑制剂，克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦。 四、氨基糖苷类1.由链霉菌属发酵滤液提取获得，有链霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；2.由小单胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福提霉素；3.半合成氨基糖苷类，有阿米卡星、奈替米星、地贝卡星等。 五、喹诺酮类1.第一代为窄谱抗生素，新恶酸、奈啶酸和恶喹酸。2.第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟沙星。3.第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、妥舒沙

16、星、左氟沙星等。 六、大环内酯类红霉素、柱晶白霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素。 七、四环素、氯霉素和林可酰胺类1.四环素为广谱抗生素，抗菌活性的顺序为米诺环素多西环素美他环素地美环素。2.氯霉素类，包括氯霉素、甲砜霉素。3.林可酰胺类，主要有盐酸林可霉素、克林霉素。八、糖肽类常用的有万古霉素和替卡拉宁 九、磺胺类药物及增效剂1.用于全身感染的药物，分短效、中效、长效三类，有磺胺甲恶唑，磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪；2.肠道起作用的药物有柳氮磺胺啶银、磺胺二甲氧嘧啶；3.局部应用的药物有磺胺米隆、磺胺醋酰钠。十、其他合成抗菌药1.硝基呋喃类用于肠道、尿路感染和外用消毒 ，有呋喃坦啶和呋喃唑酮。 2.硝基

17、咪唑类对厌氧菌有抗菌作用，对需氧菌无效，有甲硝唑和替硝唑。 二、常见药敏试验药物选择原则临床微生物实验室在分离出病原体时，必须选择合适的抗菌药物和合适的方法进行药物敏感试验。抗菌药物的选择应遵循有关指南，井与本院感染科、药事委员会和感染控制委员会的专家共同讨论决定.CLSI/NCCLSNCCLS：美国临床实验室标准化委员会的英文缩写，推荐的抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准被世界上许多国家和地区所采用。 CLSI： 2005年更名为临床实验室标准化协会。考虑习惯问题，过度时期暂称为CLSI/NCCLS。每年CLSI/NCCLS都会根据研究资料对抗微生物药物敏感性试验执行标准信息增刊（M1

18、00文件）进行修订和更新。CLSI缩写/缩写词AST抗微生物药敏试验HTM嗜血杆菌药敏试验培养基ATCC美国典型培养物收藏中心KPC肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶BHI脑心浸液LHB脱纤维马血BLNAR 内酰胺酶阴性，氨苄西林耐药MHAMH琼脂BSC生物安全柜MHBMH肉汤BSL2生物安全2级MIC最低抑菌浓度BSL3生物安全3级MRS耐甲氧西林葡萄球菌CAMHB 阳离子调节的MH肉汤MRSA耐甲氧西林金黄色葡萄球菌CDC疾病防治控制中心MSDS化学品安全技术说明书CSF脑脊液NAD烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶DMF二甲基甲酰胺PABA对氨基苯甲酸DMSO二甲基亚砜PBP 2a 青霉素结合蛋白2aESB

19、L超广谱内酰胺酶PKPD 药代动力学药效动力学FDA美国食品药品监督管理局QC质量控制HLAR高水平氨基糖甙类耐药在我国主要遵循临床实验室标准化研究所（CLSI）制定的抗菌药物选择原则。A组，包括对特定菌群的常规试验并常规报告的药物；B组，包括一些临床上重要的，特别是针对医院内感染的药物，也可用于常规试验，但只是选择性地报告；C组，包括一些替代性或补充性的抗菌药物，在A、B组过敏或耐药时选用；U组（“泌尿道”） ，仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物；O组（“其他”） ，对该组细菌有临床适应证但一般不允许常规试验并报告的药物。Inv 组（“研究性”），对该菌群作研究用且尚未经FDA批准的药物。A组所

20、列的抗生素为常规首选药敏试验药物,B组为临床使用主要抗生素,尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使用：1.对A组同类抗生素耐药；2.标本来源不同时，如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶唑使用于尿道分离的细菌；3.多种微生物感染；4.多部位感染；5.感染流行的控制；6.对A组抗生素过敏、耐受或无反应。C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或对A组药物过敏的病人和某些不常见的细菌（如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠球菌）。U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道外分离菌的常规药敏试验。对营养物质的要求非苛养菌营养要求不高，普通培养基中生长苛养菌营养要求高，普通培养基中不生长或难以生长

21、，需含生长因子或特殊营养成分方能生长（一）非苛养菌药敏试验抗生素的选用A组常规试验并常规报告的抗生素，如葡萄球菌属用苯唑西林和青霉素。B组常规试验有选择报告的抗生素，如肠球菌属用万古霉素 。C组补充试验有选择报告的抗生素，如葡萄球菌属用氯霉素 。U组仅用于泌尿道的补充实验的抗生素，如葡萄球菌属用洛美沙星和诺氟沙星。（二）苛养菌药敏试验抗生素的选用A组常规试验并常规报告的抗微生物药，如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。B组常规试验有选择报告的抗微生物药，如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松。C组补充试验有选择报告的抗微生物药，如肺炎链球菌用头孢呋辛。第二节 抗菌药物敏感试验方法敏感（S）即表示测试菌可被测

22、定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制耐药（R）即表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。中介（I）提示该细菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗效。 CLSI1. 敏感（S）“敏感”类表示当对感染部位使用推荐剂量时，该菌株通常被抗微生物药物浓度可达到的水平所抑制。2. 中介（ I ）“中介”类包括这些菌株，其抗微生物药物MIC接近于血液和组织中通常可达到的水平，而抗微生物药治疗的反应率可能低于敏感株。“中介”分类意味着药物在生理浓集部位具有临床效力(如尿液中的喹诺酮类和内酰胺类)或者可用高于正常剂量的药物进行治疗

23、(如内酰胺类)。此分类还包括一个缓冲区，它可以避免微小的、未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误，特别是对那些药物毒性范围窄的药物。3. 耐药（ R ）耐药类是指按常规剂量表，在抗微生物药通常可达到的浓度时，菌株不能被抑制；或/和表明抑菌圈直径缩小到菌株可能产生了特殊的微生物耐药机制（如-内酰胺酶）的范围内，并且用于M02- A10 和M07-A 8 文件M100- S2017治疗研究显示药物对菌株临床疗效并不可靠。4. 非敏感（ NS ）该范畴适用于某些细菌只指定了敏感的解释标准，因为缺乏或罕见耐药菌株。若MIC高于敏感临界值或抑菌圈直径小于敏感临界值，则应报告为非敏感。注1：非敏感的细菌

24、不一定是指该细菌存在某种耐药机制，可能有这种情况，就是无耐药机制而MIC 值高于敏感临界值的细菌可能是遇到了野生株，对其只设定了敏感临界值，注2：对于结果为“非敏感”的菌株，细菌的鉴定和药敏试验都应予以确证。AST意义1.预测抗菌治疗的效果2.指导抗菌药物的临床应用3.发现和提示细菌的耐药机制，合理选择药物4.监测细菌耐药性变化，控制和预防耐药菌的流行5.评价新药6.鉴定细菌方法纸片扩散法稀释法常量肉汤稀释法微量肉汤稀释法琼脂稀释法抗菌药物梯度法自动化仪器法一、纸片扩散法（一）纸片扩散法（K-B）法，WHO推荐为定性药敏试验的基本方法。（一）实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼

25、脂平板上纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对測定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。（二）实验用材料1.培养基水解酪蛋白琼脂（MHA）培养基是CLSI推荐采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，pH为7.27.4，对营养耍求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌，链球菌等需加入补充物质。琼脂厚度为4mm。配置琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中4保存，使用前应将平板置35 ；温箱孵育15分钟，使其表面干燥。2.抗菌药物纸片选择直径为6.35m

26、m，吸水量为20l的专用药敏纸片，用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定所示（表8-5）。含药纸片密封贮存28或-20.0 无霜冷冻箱内保存，内酰胺类药敏纸片应冷冻保存，且不超过1周；使用前将贮存容器移至室温平衡12小时，避免开启贮存容器时产生冷凝水。3.菌液（1）药敏标准比浊管的制备0.048mol/L（1.175%）BaCl2 0.5ml0.18mol/L（1%）H2SO4 99.5ml两者充分混匀，分装试管，置室温下暗处保存。使用前混匀，每半年重配一次。其浊度相当于0.5麦氏比浊标准，相当于1.5*108/ml的含菌量。（2）被检菌液的制备生长法：用接种环挑取已分纯的被检菌落45个，接种

27、于35mlMH肉汤，35培养4h，用NS或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏单位。直接调制法：用接种环挑取菌落悬浮于NS中，振荡混匀，调整浊度至0.5麦氏管。校正后的菌液应在15min内接种平板。（三）实验方法1.用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂抹接种3次，每次旋转平板60，最后沿平板内缘涂抹1周；2.平板置室温下干燥35分钟，用纸片分配器或无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距24mm，纸片距平板内缘15mm，纸片贴上后不可再移动，因为抗菌药物会自动扩散到培养基内；3.置35孵育箱1618小时后阅读结果，对甲氧西林和万古霉隶敏感试验结果应孵育24小时。

28、24mm15mm（四）结果判断和报告用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径（抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域）。先量取质控菌株的抑菌坏直径，以判断质控是否合格。然后量取试验菌株的抑菌环直径。根据CLSI标准，对量取的抑菌圈直径作出“敏感”、“耐药”和“中介”的判断。特殊要求1.葡萄球菌对苯唑西林的药敏试验或肠球菌对万古霉素的药敏试验，需要用透射光量取抑菌圈，如围绕纸片周围只要有极少细菌生长均提示为耐药。2.对其他菌，在抑菌圈内有散在菌落生长提示可能是混合培养，必须再分离鉴定及试验，也可能提示为高频突变株。3.变形杆菌迁徙生长，使抑菌圈生成的薄层菌可忽略不计。4.链球菌应检测生长抑菌圈而不是溶血圈5

29、.培养基含有甲氧芐啶和磺胺拮抗物，可使抑菌圈内有轻微的细菌生长，生长层小于20%可忽略不计。变形杆菌迁徙生长（五）质量控制1.影响因素（1）培养基选择水解酪蛋白琼脂（MH）培养基，因其钙、镁离子含量适中，且不含有与磺胺药物拮抗的物质，含磺胺药物的纸片的抑菌环不致受影响。检测肺炎链球菌敏感性时，要求在培养基中加入5脱纤维羊血；检测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌敏感性时，分别使用嗜血杆菌试验培养基（HTM）和GC琼脂基础1特定的生长补充品。要求琼脂平板厚度为4mm，pH（7.30.1）。（2）含药纸片必须经过质量鉴定。纸片要求酸碱度中性，直径6.35mm，含药纸片应低温保存，20保存不超过1年，日常可取出1

30、周用量存放于4冰箱。含药纸片应避免受潮，盛纸片的容器自冰箱或冰冻箱取出后，必须置室温12h后再打开取出纸片使用，以避免冷凝水浸湿纸片。含药纸片与平板边缘至少相距15mm，纸片与纸片间中心点至少相距24mm。含药纸片贴在琼脂上不得再移动，否则会因部分药液渗入琼脂而影响试验结果。（3）接种菌量从孵育1824h的血平板培养物中，挑取45个菌落，制成0.5麦氏浊度的菌悬液。用棉拭子沾取菌悬液在MH平板上依3个方向（转60）涂划，以保证接种物均匀分布。（4）孵育接种菌液后，待琼脂表面水分稍干后，即按要求贴上含药纸片，15min内放入35孵箱孵育，培养1618小时后判读结果。苛养菌的平板应放在5CO2孵箱

31、中孵育2024小时苯唑西林、甲氧西林、奈夫西林和万古霉素的药敏试验需培养24小时平板最好单独摆放，重叠最多不能超过2个。（5）判定结果用刻度尺或游标卡尺准确量取抑菌环直径。抑菌环直径以肉眼见不到细菌明显生长为限。如变形杆菌抑菌环内出现蔓延生长，磺胺类药物抑菌环内出现微量生长，均忽略不计。判读药敏试验结果应参考CLSI 最新公布的折点表。2.质量控制（1）质控菌质控菌株，从国家菌种保藏中心购置金黄色葡萄球菌 ATCC25923大肠埃希菌ATCC25922铜绿假单胞菌ATCC27853粪肠球菌 ATCC29212ATCC：美国标准生物品收藏中心（2）质控方法用质控菌株按标准方法与临床标本分离菌株同

32、步进行药敏试验。测定质控菌的抑菌环，以对照监测。三级医院每天用质控菌株进行常规监控，二级医院每周监测1次。每次测试结果应作记录。（3）抑菌圈的质控范围如出现抑菌环直径超出可接受范围，应从培养基、抗菌药物、接种浓度等方面寻找原因，并及时纠正。二、稀释法（定量）1.肉汤稀释法原理以MH（水解酪蛋白）液体培养基将抗菌药物做不同浓度的稀释，然后定量接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低（或最小）抑菌浓度（MIC）方法培养基：MH液体培养基，苛养菌需要增加营养成分。配制妥后25校正Ph7.27.4。药物稀释：药物原液的制备和稀释关照CLSI指南进行。有常量法（肉汤量1ml）和微量法（肉汤量=0

33、.1ml）两种。菌种接种：配制0.5麦氏单位的菌液。菌液应在15min内接种完毕。孵育。结果判断：试管或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度（MBC）2.琼脂稀释法培养基：将已稀释的药物按1：9加于4550已融化的MH琼脂中，充分混匀，倒板后琼脂厚度34mm，凝固后置密封袋28 备用，可保存5天，易降解的抗菌药物在使用48小时内配制平板。接种细菌，将0.5麦氏单位的菌液稀释10倍，以多点接种器吸取约12微升菌液，接种于琼脂表面，稀释后的菌液应在15min内接种完毕，接种量为1*104CUF/点。孵育。结果判断：将平板置黑色无反光的表面判断，以抑制细菌生长的

34、药物稀释度为终点。药敏实验结果可用MIC（g/ml）报告，也可对照CLSI用S、R、I报告。三、E试验（一）原理E试条是一条 5mm50mm的无孔试剂载体，一面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。 （二）细菌接种和加样使用厚度为4mmMH琼脂平板，用0.5麦氏浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用E试验加样器将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧 密接触，试

35、条MIC刻度面朝上浓度最大处靠平板边缘。（三）结果判断和报告 读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。 与NCCLS的稀释法MIC参考值高度相关。四、联合药物敏感试验1.联合药物敏感试验意义体外联合药敏试验的目的：扩大抗菌谱，治疗混合感染；预防或推迟细菌耐药性的发生；联合用药可以减少剂量以避免达到毒性剂量；对某些耐药细菌引起的严重感染，联合用药比单一用药时效果更好。抗菌药物联合用药可出现4种结果：无关作用，两种药物联合作用的活性等于其单独活性；拮抗作用，两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性；累加作用，两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和；协同作用，两种药物联合作用显著大于其单独作用的

36、总和。临床和实验室期盼的协同作用在下列情况可发生：联合用药的抗菌药物在不同部位抑制细菌细胞壁合成或封闭细菌的新陈代谢；内酰胺类与氨基糖苷类药物联合，增加了后者进入细菌细胞；内酰胺类与内酰胺酶抑制剂联合，抑制内酰胺酶的活性。联合药敏试验的操作较为费时费力，但当临床医生希望联合用药治疗时，需要做联合药物敏感性试验。五、仪器法半自动或全自动细菌鉴定和药敏系统，通过系统中药敏专家系统可报告分离菌的药敏结果。第三节 结核分枝杆菌的药物敏感试验 一、抗分枝杆菌药物第一线药物为异烟肼、利福平、吡酸胺、乙胺丁醇；第二线药物包括链霉素、氧氟沙星、环丙沙星、乙硫异烟胺、司帕沙星和利福喷汀。 二、结核分枝杆菌体外药

37、敏试验（一）结核分枝杆菌体外药敏试验指征首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于合理用药和监测药物敏感性。另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核病和结核性脑膜炎）以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外药敏试验。（一）结核分枝杆菌体外药敏试验方法由于分枝杆菌生长缓慢，在分枝杆菌生长前，药物已扩散至培养基中，不能有效影响其生长。故常规用于需氧或兼性厌氧菌的药敏试验方法不适用于结核分枝杆菌。1.绝对浓度法（1）抗结核药物溶液的配制和稀释抗菌药物直接来自厂商，不能用治疗的抗结核药物作为试验用药。药物原液浓度至少为1000g/ml，-20贮存期6个月。（2）含药培

38、养基的制备每100ml改良罗氏培养基加入1ml稀释妥的抗结核药液，混匀，无菌分装7ml/管，85凝固50min，无菌试验后4 避光保存，1m内使用。（3）菌悬液的制备临床分离的新鲜培养物（初生长2周），直接做药敏试验。初生长2周后和贮存培养物须在改良罗氏培养基上2次传代，取23周的亚培养物进行试验。配制成1mg/ml的菌悬液（4）接种将上述菌悬液稀释至10-2mg/ml，取0.1ml接种至培养基，此时每管菌量为10-3mg。374周。（5）结果报告方式第四节 细菌的耐药性检查细菌耐药性检查可以通过纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验测出细菌的抑菌圈直径、MIC，再根据CLSI标准判断细菌对药物的耐药

39、性。一、细菌耐药性与耐药机制 1.产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；水解酶：主要指-内酰胺酶，包括广谱酶、超广谱-内酰胺酶（ESBLs）金属酶、AmpC酶等。钝化酶：氨基糖苷类钝化酶，氯霉素乙酰转移酶、红霉素脂化酶等。修饰酶：氨基糖苷类修饰酶2.抗菌药物作用靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶的改变等；3.抗菌药物渗透障碍，包括细菌生物被膜形成和通道蛋白丢失；4.药物的主动转运系统亢进。上述四种耐药机制中，第一、二种耐药机制具有专一性，第三、四种耐药机制不具有专一性。1.葡萄球菌属的天然耐药对第一代喹诺酮类天然耐药。腐生葡萄球菌对磷霉素天然耐药。耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌对所有-内酰胺类抗菌药物耐药。包括青霉素类、头孢菌素类、含酶抑制剂的复合制剂、碳青霉烯类、氨曲南、头霉素类。2.肠球菌的天然耐药对14代头孢菌素、克林霉素、磺胺类、氨基糖苷类（高浓度除外）天然耐药。可选范围：青霉素、氨苄西林、万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、头孢硫脒等。3.链球菌天然耐药肺炎链球菌对第一代喹诺酮类药物耐