遗传学_基因表达调控

1、会计学1遗传学遗传学_基因表达调控基因表达调控何谓表达？何谓表达？ 表达涉及两个环节：转录、翻译表达涉及两个环节：转录、翻译. . 基 因 工 程 中基 因 工 程 中 “ 高 表 达高 表 达 ” h i g h l e v e l expression，即高的蛋白质产量。即高的蛋白质产量。哪些基因被转录，哪些基因被转录，转录的效率如何。转录的效率如何。mRNA类型，类型，mRNA数量。数量。蛋白质的类型，蛋白质的类型，蛋白质的数量。蛋白质的数量。特定细胞的功特定细胞的功能和属性。能和属性。细菌的乳糖代谢细菌的乳糖代谢乳糖操纵子乳糖操纵子一、酶的诱导与阻遏一、酶的诱导与阻遏 1900年，年，

2、Dienert首次注意到酶的诱首次注意到酶的诱导作用，在酵母细胞的培养中，存在乳导作用，在酵母细胞的培养中，存在乳糖时，细胞产生与乳糖利用有关的酶；糖时，细胞产生与乳糖利用有关的酶；把细胞转移到含葡萄糖的培养基，这种把细胞转移到含葡萄糖的培养基，这种酶即消失酶即消失. 结论：结论：底物的存在能专一地诱导酶的底物的存在能专一地诱导酶的产生。产生。 当培养基中有乳糖（当培养基中有乳糖（lactose），而），而无葡萄糖时，细菌中专门代谢乳糖的酶类无葡萄糖时，细菌中专门代谢乳糖的酶类就迅速增加。就迅速增加。 乳糖（乳糖（lactose）既是底物（）既是底物（substrate）又起到了诱导物（）又起

3、到了诱导物（inducer）的作用。）的作用。1953年年Monod发现酶的发现酶的阻遏作用阻遏作用 大肠杆菌培养基中的色氨酸阻遏了色氨大肠杆菌培养基中的色氨酸阻遏了色氨酸合成酶的合成酸合成酶的合成.同等诱导或同等阻遏同等诱导或同等阻遏:大肠杆菌合成色氨酸所大肠杆菌合成色氨酸所需的酶，需的酶，5个编码基因串联在一起，而且排列个编码基因串联在一起，而且排列顺序也跟基因产物所催化的反应顺序相同。这顺序也跟基因产物所催化的反应顺序相同。这种成串现象由种成串现象由Demerec等人于等人于1955年首先观察年首先观察到。到。 从从1946年起及随后的年起及随后的10年，年，Jacques Monod、

4、Joshua Lederberg、Francois Jacob以及以及Andre Lwoff 对乳糖对乳糖代谢的遗传学和生物化学进行了系统的研代谢的遗传学和生物化学进行了系统的研究。究。 E.coli能以乳糖（葡萄糖能以乳糖（葡萄糖-4-D-半乳糖苷）半乳糖苷）这种双糖作为唯一碳源。这种双糖作为唯一碳源。 乳糖进入细胞后被分解为半乳糖和葡萄糖乳糖进入细胞后被分解为半乳糖和葡萄糖. 与乳糖代谢有关的三种酶：与乳糖代谢有关的三种酶： -半乳糖苷酶：水解乳糖为半乳糖和葡萄糖；半乳糖苷酶：水解乳糖为半乳糖和葡萄糖； - -半乳糖苷透性酶：一种膜蛋白，协助乳糖穿半乳糖苷透性酶：一种膜蛋白，协助乳糖穿膜进

5、入细菌细胞内。膜进入细菌细胞内。 巯基半乳糖苷转乙酰酶：将一个乙酰基从乙酰巯基半乳糖苷转乙酰酶：将一个乙酰基从乙酰辅酶辅酶A A转移到转移到-半乳糖苷上。半乳糖苷上。 三种酶的编码基因分别命名为三种酶的编码基因分别命名为lacZ 、 lacY和和lacA，统称为统称为结构基因结构基因，在染色体上相连在一起。，在染色体上相连在一起。lacZ：编码编码 -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（ -galactosidase）四聚体，分解乳糖。四聚体，分解乳糖。乳糖乳糖半乳糖半乳糖+葡萄糖葡萄糖 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶lacY：编码编码 -半乳糖苷透性酶（半乳糖苷透性酶（permeasae）。）。膜蛋白，将乳糖转

6、运到细胞中。膜蛋白，将乳糖转运到细胞中。 lacA：编码编码 -半乳糖苷乙酰转移酶（半乳糖苷乙酰转移酶（transacetylase）。二聚体）。二聚体; 把乙酰把乙酰辅酶辅酶A上的乙酰基转移到上的乙酰基转移到 -半乳糖苷半乳糖苷上。上。 培养中培养中C源不是乳糖时，三种酶在细胞内的含源不是乳糖时，三种酶在细胞内的含量很低，只有几个分子或不到。量很低，只有几个分子或不到。 如果用乳糖代替葡萄糖，则在几分钟内，每个如果用乳糖代替葡萄糖，则在几分钟内，每个cell转录出转录出30-50个个mRNA模板，产生模板，产生3000多个多个-半半乳糖苷酶分子，另两种酶的量也迅速增加，一旦乳乳糖苷酶分子，另

7、两种酶的量也迅速增加，一旦乳糖耗尽，三种酶的合成同时停止。糖耗尽，三种酶的合成同时停止。 这里，乳糖被当作诱导物，并被这里，乳糖被当作诱导物，并被-半乳糖苷酶半乳糖苷酶催化分解，一些不能被该酶分解的半乳糖苷也可作催化分解，一些不能被该酶分解的半乳糖苷也可作为诱导物，如为诱导物，如IPTG （异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷）硫代半乳糖苷） IPTG有诱导效应而本身不被分解，称为安慰有诱导效应而本身不被分解，称为安慰诱导物诱导物(gratuitous inducer) constitutive 不需诱导、持续地合成. 诱导型的合成（如-半乳糖苷酶也可能产生组成型突变体mutant） 乳糖操纵子模型

8、有关的试验中，利用了： 组成型突变体 部分二倍体技术（性导, F因子）组成型合成组成型合成Joshua Lederberg为了研究乳糖代谢为了研究乳糖代谢的三个酶的基因，分离了大量的突变体的三个酶的基因，分离了大量的突变体（lac -），并经过遗传作图发现它们是），并经过遗传作图发现它们是紧密连锁的：紧密连锁的：Z-Y-A同时发现它们是被同时诱导转录的。同时发现它们是被同时诱导转录的。1960年，年，Jacob和和Monod提出了操纵子提出了操纵子模型，说明乳糖诱导代谢是一个负控制模型，说明乳糖诱导代谢是一个负控制（negative control）。）。获获1965年年Nobel生理学和医学

9、奖生理学和医学奖 LacI 编码了一个编码了一个阻遏物阻遏物(repressor)，与结构基因附近的一个，与结构基因附近的一个“假想假想”位置（位置（命名为命名为operator site）结合）结合, 从而抑制结从而抑制结构基因的转录。构基因的转录。 该阻遏物能变构（该阻遏物能变构（allosteric）。即）。即它还能与乳糖结合，改变构像而丧失了它还能与乳糖结合，改变构像而丧失了与与operator DNA结合的能力，结构基因结合的能力，结构基因才能够转录表达。才能够转录表达。 调节基因编码的产物是一调节基因编码的产物是一种蛋白质分子，称为阻遏物。种蛋白质分子，称为阻遏物。当培养基内没有乳

10、糖时，阻遏当培养基内没有乳糖时，阻遏物结合到操纵基因上，阻止了物结合到操纵基因上，阻止了RNA聚合酶的通过，所以结构聚合酶的通过，所以结构基因得不到转录。基因得不到转录。 培养基加入乳糖后，乳糖培养基加入乳糖后，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏物的构象改变。阻遏物使阻遏物的构象改变。阻遏物的构象改变后，失去了与操纵的构象改变后，失去了与操纵基因结合的能力，阻遏物从操基因结合的能力，阻遏物从操纵基因上解离下来。于是转录纵基因上解离下来。于是转录得以进行。得以进行。 Jacob和和Monod未提出启动基因区（未提出启动基因区（RNA聚聚合物识别并结合的区域）合物识别并

11、结合的区域）P（Promotor，又叫启又叫启动子）动子） ,后来由伊彭提出。后来由伊彭提出。 启动子：由两个盒组成，以转录起始点为启动子：由两个盒组成，以转录起始点为+1+1，-35-35的的TTGACATTGACA盒是盒是RNARNA聚合酶的识别位点，聚合酶的识别位点，-10-10的的TATAATTATAAT盒（盒（PribnowPribnow盒），是盒），是RNARNA聚合酶的结合位点。聚合酶的结合位点。 这样，操纵子的概念：最初的操纵子这样，操纵子的概念：最初的操纵子= =操纵基因操纵基因+ +结构结构基因，进一步成为基因，进一步成为 操纵子包括：启动基因操纵子包括：启动基因+ +操纵

12、基因操纵基因+ +结构基因。结构基因。 操纵子（操纵子（operon）: 功能相关的结构基因在染功能相关的结构基因在染色体上成簇（色体上成簇（cluster）排列）排列, 由一个共同的控制区由一个共同的控制区调控基因的转录调控基因的转录,是原核生物转录调控的基本单位是原核生物转录调控的基本单位.由由结构基因结构基因（structural genes）和上游相邻的）和上游相邻的控控制区制区（regulatory region）组成。）组成。 一个操纵子转录后形成一个一个操纵子转录后形成一个多顺反子多顺反子mRNA(polycistronicmRNA(polycistronic) )。对模型的遗传

13、学验证对模型的遗传学验证组成型突变（组成型突变（constitutive mutants）没有乳糖，代谢酶照样合成（不需要诱导）。没有乳糖，代谢酶照样合成（不需要诱导）。遗传作图发现：遗传作图发现：这种突变（这种突变（lacOc）的基因紧密连锁在）的基因紧密连锁在结构基因的上游（结构基因的上游（operator region）。另一个组成型突变（另一个组成型突变（lacI-）作图的结果）作图的结果是在离结构基因不远处。是在离结构基因不远处。野生型野生型lacOclacI-根据操纵子模型的原理，可以预测：根据操纵子模型的原理，可以预测：模型预测模型预测1. lacI基因产物是个可扩散的（基因产物

14、是个可扩散的（diffusible）蛋白。）蛋白。2. O区（区（operator region）在调节过程）在调节过程中起作用，但不编码产物。中起作用，但不编码产物。3. O区必须紧靠结构基因。区必须紧靠结构基因。 Pardee、Jacob、Monod设计设计了历史性的实验来检验他们的模型的了历史性的实验来检验他们的模型的预测是否正确。预测是否正确。1. 实验原理实验原理通过通过F因子，给因子，给lacI-或或lacOc的突变菌输入的突变菌输入野生型野生型lacI或或lacO基因，观察其对基因，观察其对 -半乳半乳糖苷酶活性的影响。糖苷酶活性的影响。实验实验1：组成型突变组成型突变lacI-

15、 - lacZ+ +F菌株菌株F lacI+ + lacZ- -乳糖诱导型菌乳糖诱导型菌说明说明F菌株的菌株的lacI+ +能弥补原菌株的能弥补原菌株的lacI- -缺陷。缺陷。即：即：lacI 对对lacZ是反式作用（是反式作用（trans-acting）。）。组成型突变组成型突变lacI+ + lacOc lacZ+ +F菌株菌株F lacI+ +lacO+ + lacZ- -组成型表达组成型表达说明说明F菌株的菌株的lacO+ +不能弥补原菌株的不能弥补原菌株的lacOc缺陷。缺陷。即：即：lacO对对lacZ是顺式作用（是顺式作用（cis-acting）。）。lacI超突变（超突变（l

16、acIs）编码的阻遏物不能与乳糖）编码的阻遏物不能与乳糖结合，所以总是结合在结合，所以总是结合在O区的区的DNA上，使上，使lacZ不能表达。不能表达。野生型野生型lacI+ + lacZ+ +F菌株超突变菌株超突变F lacIs lacZ+ +组成型不表达组成型不表达说明超突变说明超突变lacIs 编码的阻遏物能作用于野编码的阻遏物能作用于野生型菌操纵子的生型菌操纵子的O区。区。利用超突变：利用超突变：Jacob和和Monod1961年发表的操纵子理论是年发表的操纵子理论是遗遗 传学的的一个里程碑（传学的的一个里程碑（landmark）。）。 用遗传分析结果推论出分子生物学模型并验证。用遗传

17、分析结果推论出分子生物学模型并验证。 暗示了蛋白质与暗示了蛋白质与DNADNA结合的概念。结合的概念。描述了描述了“阻遏物阻遏物”的调节因子概念（尽管当的调节因子概念（尽管当时并不知道它是蛋白质还是时并不知道它是蛋白质还是RNARNA）。）。 当时人们刚知道当时人们刚知道mRNA，对转录的细，对转录的细节一无所知！节一无所知！阻遏物的含量极少，每细胞不超过阻遏物的含量极少，每细胞不超过10份。份。直到直到1966年，年，Walter Gilbert和和Benno Muller-Hill从从lacI的超量突变菌株中，的超量突变菌株中，利用透析（利用透析（dialysis）的方法，通过）的方法，通

18、过IPTG与阻遏物的结合作用，分离到了这与阻遏物的结合作用，分离到了这个蛋白质。个蛋白质。Gilbert及其同事又用放射自显影证明及其同事又用放射自显影证明它能与它能与lacO DNA结合。结合。 分离分离鉴定鉴定两个两个binding domian:四聚体聚合区四聚体聚合区CN一个四聚一个四聚体聚合区体聚合区i）电镜观察）电镜观察Lac repressor两个单体结合在一个完整的两个单体结合在一个完整的lacO区；区；四聚体可以结合两个四聚体可以结合两个lacO。阻遏物所结合的阻遏物所结合的DNA有有26bp（-5 +21）。位于）。位于RNA多聚酶结合部位的下游内部多聚酶结合部位的下游内部

19、。GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTATGmRNAproteinRNA pol binding siterepressor binding site对称轴对称轴Jacob-Monod 模型没能回答一个关键模型没能回答一个关键性的问题：性的问题：为什么为什么E.coli 在既含有葡萄糖（在既含有葡萄糖（glucose）又含有乳糖的（又含有乳糖的（lactose）的培养基（）的培养基（medium）中不启动）中不启动lac 操纵子的转录？操纵子的转录？Answers to this question emerged from molecular studies carried o

20、ut long after publication of the operon theory.在有些启动子上，在有些启动子上，RNA pol结合后并不能结合后并不能启动转录。必须一个激活因子（正调节因启动转录。必须一个激活因子（正调节因子）的帮助才能打开子）的帮助才能打开DNA双链。双链。CAP是是lac operon的正调节因子。的正调节因子。（2）CAP的作用原理的作用原理 cAMP+CAP cAMP-CAP复合体复合体 cAMP-CAP与与lac操纵子启动基因上操纵子启动基因上的一个位置结合后的一个位置结合后 ，RNA聚合酶才能与聚合酶才能与启动子结合。启动子结合。 cAMP是由是由AT

21、P经过腺苷酸环化酶（经过腺苷酸环化酶（Adenyl cyclase）的作用形成。）的作用形成。ATPcAMPAdenyl cyclase CAP-cAMP系统在半乳糖和阿拉伯糖系统在半乳糖和阿拉伯糖操纵子中也起作用。操纵子中也起作用。lac操纵子中，操纵子中，CAP结合位点位于结合位点位于RNA pol结合位点的上游（结合位点的上游（-22bp）。）。结合部位位置结合部位位置不同的操纵子中，不同的操纵子中，CAP的结合位置不同。的结合位置不同。operator CAP promotor 结构基因结构基因半乳糖半乳糖乳糖乳糖阿拉阿拉伯糖伯糖结构基因结构基因operatorpromotorCAP

22、operator CAP promotor结构基因结构基因以二聚体形式与以二聚体形式与DNA结结合。使合。使DNA弯曲弯曲90度。度。TGTGAGTTAGCTCACACACTCAATCGAGTG每一部分结合一个每一部分结合一个CAP。何谓表达？何谓表达？ 表达涉及两个环节：转录、翻译表达涉及两个环节：转录、翻译. . 基 因 工 程 中基 因 工 程 中 “ 高 表 达高 表 达 ” h i g h l e v e l expression，即高的蛋白质产量。即高的蛋白质产量。 1900年，年，Dienert首次注意到酶的诱首次注意到酶的诱导作用，在酵母细胞的培养中，存在乳导作用，在酵母细胞的培养中，存在乳糖时，细胞产生与乳糖利用有关的酶；糖时，细胞产生与乳糖利用有关的酶；把细胞转移到含葡萄糖的培养基，这种把细胞转移到含葡萄糖的培养基，这种酶即消失酶即消失. 结论：结论：底物的存在能专一地诱导酶的底物的存在能专一地诱导酶的产生。产生。lacZ：编码编码 -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（ -galactosidase）四聚体，分解乳糖。四聚体，分解