HPLC安捷伦高效液相使用维护常见问题PPT学习教案

1、会计学1HPLC安捷伦高效液相使用维护常见问题安捷伦高效液相使用维护常见问题2第1页/共42页第2页/共42页第3页/共42页第4页/共42页溶剂溶剂 色谱泵自动进样器 HPLC色谱柱色谱柱检测器废液数据处理系统液相色谱流程图液相色谱流程图第5页/共42页脱气装置四元泵柱温箱样品盘检测器流动相第6页/共42页溶剂溶剂棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。第7页/共42页启动液相色谱仪器的流程启动液相色谱仪器的流程 l开启开启HPLC系统各个设备的电源系统各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器

2、电源，打开计算机启动 “1260联机工作站”，待工作站图形颜色为绿色表明仪器已就绪。l排气泡排气泡打开排气阀，将流速调至5ml/min，排气5min；待流速降为0，拧紧排气阀。l80%甲醇（过滤、超声甲醇（过滤、超声15min）冲洗系统）冲洗系统使用80%的甲醇溶液冲洗系统至少30min，流速为1ml/min，待基线平稳即可进行下一步操作。注意：注意：观察柱压是否稳定，若不稳定出现大幅度柱压下降现象，很有可能是系统发生漏液，优先排查色谱柱的连接处是否漏液，其次是排气阀处，最后是观察其他管道连接处；若流动相中含有离子，80%甲醇冲洗系统之后，使用10%甲醇继续冲洗系统至少30min。否则，会有离

3、子析出，堵塞管路。柱压应小于10bar，如若过大，应更换溶剂出口过滤白头第8页/共42页启动液相色谱仪器的流启动液相色谱仪器的流程程 l流动相冲洗系统流动相冲洗系统流动相配制后，先使用过滤装置过滤，然后超声15min，排除气泡干扰。流速1ml/min，使用流动相冲洗系统至少30min，待基线平稳即可进行下一步操作。l进样测定进样测定具体操作如下：点击“序列”-“序列表”-输入相关信息确定（样品瓶、样品名称、方法名称-TEST、进样次数、进样量）-“开始序列”。待进样结束后，进行下一步操作。注意：注意：在进样前，最好用100%甲醇进行洗针，以防进样针中残留的其它样品影响实验结果。水相走A、D泵，

4、有机相走B、C泵，可防止缓冲盐析出第9页/共42页启动液相色谱仪器的流启动液相色谱仪器的流程程 l80%80%甲醇冲洗系统甲醇冲洗系统使用80%的甲醇溶液冲洗系统至少30min，流速为1ml/min，待基线平稳，将流速降为0，即可进行下一步操作。注意：若流动相中含有离子，先使用10%甲醇冲洗系统至少30min，后使用80%甲醇冲洗系统。l关闭系统关闭系统点击工作站右下角“关闭”按钮，待仪器显示未就绪，关闭1260（联机），关闭电脑，关闭液相各模块电源。拔掉总电源即结束。第10页/共42页流动相的选择流动相的选择n甲醇甲醇n质子化溶剂 氢键供给者 n洗脱能力较乙腈弱n粘度较乙腈高n低紫外波长下有

5、吸收n乙腈乙腈n非质子化溶剂 氢键接受者 n洗脱能力较甲醇强n粘度较甲醇低n低紫外波长下透光性好第11页/共42页常用溶剂的极性及截止波长常用溶剂的极性及截止波长反相液相色谱，若希望出峰时间早，可以增加流动相中有机相的比例；若希望出峰时间晚，可以增加流动相中水相比例（有机相一般不低于5%）。甲醇的极限波长为210 nm ，因此，检测波长较小时，应该选用乙腈而非甲醇；样品稀释最好选用流动相，可以避免溶剂峰的干扰。溶剂溶剂 水水甲醇甲醇乙醇乙醇异丙醇异丙醇乙腈乙腈四氢呋喃四氢呋喃极性常数极性常数1.000.950.880.820.650.57截止波长截止波长170210210210190210流动

6、相的选择流动相的选择80%甲醇冲系统基线不平第12页/共42页为了得到较好的分离效果，可以在流动相中加入一些少量的有机溶剂，如三乙胺来调节峰形变“瘦”，减少拖尾现象。加入缓冲盐，调节流动相的pH值或离子强度，以改变组分的保留时间达到分离效果等。一般情况下，大家如要建立色谱条件，应先去查询中国药典及文献资料，再进行适当的修改。流动相的调节流动相的调节第13页/共42页流动相的处理流动相的处理第14页/共42页第15页/共42页流动相的保存流动相的保存l有机溶剂流动相： 室温下密封，避光保存l缓冲盐流动相： 当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长l有机溶剂与水（缓冲盐）混配

7、的流动相： 低温密封保存 防止有机相的挥发第16页/共42页梯度洗脱是指在一个分析周期中，按一定的程序连续改变流动相中溶剂的组成（如溶剂的极性、离子强度、pH值等）和配比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离。是分析复杂混合物特别是分离保留性能相差较大的混合物的极为重要的手段。优点：改善峰形，提高柱效 缩短分析时间 强保留成分不易残留在柱上缺点：会引起基线漂移 有时重现性差 故需严格控制梯度洗脱的实验条件。能等度洗脱绝能等度洗脱绝不选择梯度洗不选择梯度洗脱脱第17页/共42页吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器进样器检测器第18页/共42页检查溶剂过滤器检查溶剂过滤器查看过滤器是否变色查看

8、过滤器是否变色临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常清洁溶剂过滤器清洁溶剂过滤器将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。先用水冲洗残留之溶剂然后将过滤器放在装有浓硝酸浓硝酸 （3535）的烧杯里浸一小时，不要使用超声波清洗用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器，将过滤器重新装好。建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次。日常维护日常维护第19页/共42页日常维护日常维护严重污染的溶剂出口过滤芯严重污染的溶剂出口过滤芯第20页/共42页日常维护日常维护溶剂出口过滤白头溶剂出口过滤白头第21页/共42页日常维护日常维护泵的保养：泵的保养：使用流动相尽量要清洁；进液处的

9、砂芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；灯的保养：灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器第22页/共42页日常维护日常维护第23页/共42页第24页/共42页专属性专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。线性线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度(一般对照品稀释成7个浓度，每个浓度进样3次，计算其线性方程和相关系数，其值不应低于0.99）。范围范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测

10、试方法适用的高低限浓度或量的区间（区间（原料药和制剂含量测定，范围应为测试浓度的80%120%）。 第25页/共42页6:1NS第26页/共42页数据要求： 在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。例如，设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。第27页/共42页绝对回收率=提取回收率/（1基质效应），HPLC中基质效应为01.绝对回收率绝对回收率=提取回收率提取回收率=萃取回收率萃取回收率，是用药品加血浆经萃取处理后的进样峰面积除以该药品溶液直接进样峰面积的比值，一般来说，该比值不可能超过100%，能做到80%就不错了。以前国家对绝对提取率还有些要求，现在随着lc-ms

11、的应用，最低定量限已经能做到很低，也就不需要再对绝对回收率提具体要求，只要相对回收率满意就可以。-生物样品：用于筛选提取溶剂，可以低但要稳定 2.相对回收率相对回收率=方法学回收率方法学回收率，是血浆处理后的进样峰面积代入血浆标准曲线，计算所得浓度除以真实血样浓度.该比值在100%左右.一般要求高、中浓度点在15%以内，低浓度点可适当放宽。-内标的相对回收率值与绝对回收率要求类似(1)举例：10ng A药加入1ml空白血浆（10ng/ml），经萃取处理后用0.5ml流动相复溶，进样所得峰面积8000;配制对照溶液（浓度10ng/0.5ml=20ng/ml），进样所得峰面积假设为10000.那么

12、萃取回收率为8000/10000=80%.(2)举例：上述经萃取处理的血浆溶液（10ng/ml）峰面积8000，代入标准曲线计算，假如计算所得浓度为8.5ng/ml,相对回收率则为8.5/10=85%.第28页/共42页制备3个不同浓度的样品，每个浓度各3份 （对照品）100%水平的供试品溶液，至少测定6次的结果进行评价第29页/共42页耐用性耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用于常规检验提供依据。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品的提取次数、时间等；液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH 值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等

13、。稳定性考察稳定性考察：取同一份供试品溶液，分别于不同时间进样测定（如0、2、4、6、8、10、12、24h）。注意：注意：大多文献中所提及的重复性考察并不在验证范围内，但较为常用重复性考察重复性考察：取同一批号供试品, 按供试品溶液制备方法制备 6 份供试液，进行含量测定。第30页/共42页第31页/共42页第32页/共42页第33页/共42页系统压力过低，不稳定或没液流。系统压力过低，不稳定或没液流。1首先拧开排液阀，设流速首先拧开排液阀，设流速12ml/min后开泵，观察有无液流，后开泵，观察有无液流，若有再仔细观察液流是否有倒吸现象如不能确定可用量筒测若有再仔细观察液流是否有倒吸现象如

14、不能确定可用量筒测量流速的准确性。量流速的准确性。2如上述无液流，或流速不准多数为主动阀阀芯或主动阀故障如上述无液流，或流速不准多数为主动阀阀芯或主动阀故障， 或泵有严重漏液。或泵有严重漏液。3怎样是大致判断主动阀抑或其阀芯故障？可用以下方法：当怎样是大致判断主动阀抑或其阀芯故障？可用以下方法：当泵运转时用手指轻捏主动主体，正常的主动阀能感到有节奏泵运转时用手指轻捏主动主体，正常的主动阀能感到有节奏的脉动，如果没有，的脉动，如果没有， 主动阀有问题。如果有则可以将主动阀主动阀有问题。如果有则可以将主动阀阀芯取出进行超声波清洗，如仍有问题，可更换阀芯。阀芯取出进行超声波清洗，如仍有问题，可更换阀

15、芯。注意注意，千万不要把整个主动阀放入超声波清洗这样会损坏主动阀，千万不要把整个主动阀放入超声波清洗这样会损坏主动阀。4若上述流速准确但拧紧排液阀后压力不稳定，请仔细检查有若上述流速准确但拧紧排液阀后压力不稳定，请仔细检查有无漏液。无漏液。(通常漏液地方：各接口包括色谱柱，泵，进样阀等通常漏液地方：各接口包括色谱柱，泵，进样阀等)。第34页/共42页保留时间不稳定。保留时间不稳定。 首先观察保留时间是否有规律的变化，并同时观察压力是否稳定首先观察保留时间是否有规律的变化，并同时观察压力是否稳定 若压力稳定而保留时间呈有规律变化，若压力稳定而保留时间呈有规律变化，多数是色谱柱未平衡好，多数是色谱

16、柱未平衡好，特别是含有盐的流动相，需较长的时间去平衡。特别是含有盐的流动相，需较长的时间去平衡。 若压力稳定而保留时间无规律变化，若压力稳定而保留时间无规律变化，请检查溶剂过滤头及真空腔请检查溶剂过滤头及真空腔是否有堵塞。再平衡色谱柱足够时间，如仍然不佳，可更换一是否有堵塞。再平衡色谱柱足够时间，如仍然不佳，可更换一色谱柱。色谱柱。 若压力不稳定，若压力不稳定，请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。第35页/共42页峰面积重现性不好。峰面积重现

17、性不好。 首先观察压力是否稳定，以及观察峰面积变化是否有规律。首先观察压力是否稳定，以及观察峰面积变化是否有规律。 若压力不稳定，若压力不稳定，请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。 若压力稳定但峰面积呈无规律变化，若压力稳定但峰面积呈无规律变化，请检查样品是否足够，确认样请检查样品是否足够，确认样品的稳定性，必要时重新配制。检查进样阀是否漏液。等。品的稳定性，必要时重新配制。检查进样阀是否漏液。等。 若压力稳定且若压力稳定且峰面积呈规律变化

18、，峰面积呈规律变化，多数为色谱柱未平衡好。多数为色谱柱未平衡好。 双峰 ：进样量过大？预柱有气泡？-纯甲醇超声拖尾峰：流动相中添加三乙胺等减尾剂峰展宽：流动相粘度过高？：流动相粘度过高？-提高柱温提高柱温峰前延：柱温低第36页/共42页基线不稳定。基线不稳定。基线漂移：基线漂移：色谱柱未平衡好，柱温未稳定，流动相变化等。色谱柱未平衡好，柱温未稳定，流动相变化等。基线噪音：基线噪音：可能原因是：流动池有气泡，流动可能原因是：流动池有气泡，流动 池被污染，对紫外检测器可将流动池被污染，对紫外检测器可将流动池移走即可确认。池移走即可确认。色谱柱和或系统受污染。色谱柱和或系统受污染。 灯能量不足。灯能量不足。 外界因素影响，如电源，温度和湿度，震动，等。外界因素影响，如电源，温度和湿度，震动，等。 第37页/共42页后运行命令：后运行命令：序列-序列参数-后序列命令/宏-stand b