DNA重组克隆的单元操作

1、12（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；（2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中；（3）具有容易检测的筛选标记；（4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；（5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。 31. 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；2. 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有

2、强启动子；3. 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。4567891011121314重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50 - 100 / cell用于基因克隆用于基因克隆 15pUC质粒载体 (1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)；

3、(2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点； (3)大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ1基因； (4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏lacZ 基因的功能。pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIH

4、ind IIBal IApr16pUC18 pUC18 / 19/ 19： 拷贝数拷贝数 2000 - 3000 / 2000 - 3000 / cellcell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII1718(2)表达载体19202122该载体具有

5、以下优点：该载体具有以下优点：可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。IPTG可诱导tac启动子进行高效表达。融合蛋白极易纯化。GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。23QIAexpress 6His表达系统n该系统为Ni-NTA基质对带6个组氨酸残基的重组蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统，n优点：6His比其它标记更小，可用于任何表达系

6、统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白酶把6His切除。生理pH条件下6His不带电荷，所以不影响蛋白质的分泌。因5His免疫原性差，所以无需去除6His, 重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。2425GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG环化作用环化作用2627基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：282930调节元件或调节基因产物及功能PL,OL, PR,OR左右向转录的启动子和操纵子tR (1,2,3,4,5)右向转录的终止子tL(1,2)左向转录的终止子PRE C蛋白建立启动子，受C蛋白调控PIint基因启动子，受C蛋白调

7、控PaQQ蛋白反义RNA启动子，受C蛋白调控PRMC蛋白基因维持启动子，受C浓度调控PR晚期转录的启动子nutnutL, , nutnutRN蛋白左右两个反终止结合位点qutQ蛋白反终止结合位点croPL和PR的阻遏蛋白，并可阻遏PE，抑制 CI 表达cIPL 和PR 的主要的阻遏物，并可自主调控PRMc可以启动PRE 、PI 和PAQ，使进入溶原化途径31c和C组成复合物，启动PE产生c及cro的反义RNANtR1, tR2及tL1的反终止蛋白QtR4的反终止蛋白. O, PDNA复制所需的蛋白S, R, R2裂解宿主所需的裂解酶int整合酶，使整合到宿主的染色体中xis切除酶，帮助在att

8、位点和宿主连接bet, exo重组蛋白，帮助和宿主进行重组W, B, N u3, C, D, E, F, F,Z头部蛋白基因U, V, G, T, H, M, L, K, I, J尾部蛋白基因cos (cohesive)12bp的回文序列，由线状连接成环状的连接点，A蛋白切割位点A末端酶，识别cos位点，包装时将环连体切成单个的基因组32 基因组太大（基因组太大（49kb）；）； 酶切点太多，它有酶切点太多，它有5个个BamH1位点（位点（GGATCC），），6个个Bg位点位点（AGATCT），），5个个EcoR位点（位点（GAATTC）。）。 野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的

9、DNA。若相当于若相当于噬菌体的噬菌体的75-105%，那么只能接纳那么只能接纳49kb5%=2.45kb的的DNA。 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；或更大）； 去处太多的酶位点，每种酶只留去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；个切口； 增加标记基因（增加标记基因（remarke gene）。）。(4)(4) 引入无义突变引入无义突变噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：33341.噬菌体载体的类型置换型载体：可被外源DNA置换的噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。 插入型载体：有一类只含一个限制

10、性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。 35注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb 52kb。体外包装：噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白 36371.1.粘粒的组成及性质：粘粒的组成及性质：n它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA 克隆的最大 DNA 片段可达45kbn质粒复制起点（colE1） 象质粒一样转化和增殖n抗性标记amprn cos位点n有的粘粒载体含有两个cos位点38pHC79pHC796400 6400 bpbpTcTcrl l fragment fragmentcoscosorioriApAprPstIPst

11、IBamHIBamHISalISalIl l-DNA -DNA coscos序列和序列和质粒复制子的质粒复制子的coscos site - carrying plasmid site - carrying plasmid 1.8 1.8 kbkb的的l l-DNA-DNA片段片段 + + pBR322pBR322片段片段 装载范围为装载范围为31 - 45 31 - 45 kbkb392.柯斯质粒pHC79系403.柯斯质粒有以下优越性：41424.采用柯斯质粒作载体的困难43四、M13 噬菌体载体n单链DNA噬菌体是一类丝状的大肠杆菌噬菌体，由单链环状DNA分子外面包裹上一层蛋白质外壳而成。

12、nM13噬菌体是单链DNA噬菌体中的一个典型的代表。441.M13噬菌体的组成和结构nM13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。45n单链DNA，由6407碱基组成。n90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因n基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因和基因以及基因和基因之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。2.M13噬菌体的基因组的基因组n编码3类蛋白质：复制蛋白（基因，和）形态发生蛋白（基因，和）结构蛋白（基因、和）463. M13噬菌体载体的构建 M13噬菌体作为载体具有几个

13、重要的特点：M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中；M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。外源片段插入位点在基因和基因之间的508bp间隔区-M13不像噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因/和基因/之间

14、）。4748M13mp18 和 M13mp19n这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段，这两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。n当RF DNA被两种不同的限制酶切割以后， M13mp18 和 M13mp19 轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链DNA片段时，方可闭合成环。49n这一片段在 M13mp18 和 M13mp19 中将以两个互为相反的方向插入。这样一来，在 M13mp18 的正链中含有外源 DNA 双链的其中一条链，而在 M13mp19 正链中则含有外源 DNA 的另一条链，即

15、M13mp18 重组体的子代噬菌体内含有外源 DNA 的一条链，M13mp19重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。n故用 M13mp18 和 M13mp19 作为一对载体，就可能用一个引物（通用引物），从所插入 DNA 片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的 DNA 序列，并可制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。50M13噬菌体产生单双链DNA的机制：1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成

16、，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 。4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 51病毒载体概述（病毒载体概述（1）要求：要求：1 1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2 2、介导外源基因转移和表达、介导外源基因转移和表达 3 3、对机体不致病、对机体不致病容量：容量：自身基因组大小的自身基因组大小的105%110105%110% 类型：类型

17、：1 1、重组型病毒载体、重组型病毒载体 2 2、无病毒基因的病毒载体、无病毒基因的病毒载体 复制缺陷型复制缺陷型 可复制型可复制型 复制缺陷型复制缺陷型组成：组成：1 1、病毒复制和包装元件、病毒复制和包装元件 2 2、病毒基因、病毒基因 3 3、插入的外源基因或元件、插入的外源基因或元件 4 4、病毒外壳、病毒外壳/ /外膜外膜 用途：基因转移和表达用途：基因转移和表达 1、基因治疗、基因治疗 2、疫苗、疫苗 3、器官移植、器官移植 4、组织工程、组织工程 5、转基因动物、转基因动物 6、基因功能研究、基因功能研究 五、病毒载体五、病毒载体52病毒载体概述（病毒载体概述（2）优点：优点：1

18、 1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2 2、复杂的装配过程由细胞完成；、复杂的装配过程由细胞完成； 3 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点、不同的病毒载体具有不同的表达特点。存在的问题：存在的问题：1 1、安全性、安全性2 2、靶向性、靶向性3 3、有效性、有效性细胞毒性细胞毒性染色体毒性染色体毒性免疫毒性免疫毒性转导靶向性转导靶向性转录靶向性转录靶向性转导效率转导效率靶向性靶向性基因表达水平和持续时间基因表达水平和持续时间表达的可调控性表达的可调控性53病病 毒毒 载载 体体生生 物物 学学 特特 性性适适 用用 范范 围围反反 转

19、转 录录 病病 毒毒 载载 体体 单单 链链R N A 病病 毒毒 8 1 0 k b可可 感感 染染 分分 裂裂 细细 胞胞 ；整整 合合 到到 染染 色色 体体 中中 ；表表 达达 时时 间间 较较 长长 ；有有 致致 癌癌 的的 危危 险险 ；E x v iv o 基基 因因 治治 疗疗 ；肿肿 瘤瘤 基基 因因 治治 疗疗 。腺腺 病病 毒毒 载载 体体 双双 链链D N A 病病 毒毒 3 6 k b可可 感感 染染 分分 裂裂 和和 非非 分分 裂裂 细细 胞胞 ；不不 整整 合合 到到 染染 色色 体体 中中 ；外外 源源 基基 因因 表表 达达 水水 平平 高高 ；表表 达达

20、时时 间间 较较 短短 ；免免 疫疫 原原 性性 强强 ；In v iv o 基基 因因 治治 疗疗 ；肿肿 瘤瘤 基基 因因 治治 疗疗 ；疫疫 苗苗 。A AV 病病 毒毒 载载 体体 单单 链链D N A 病病 毒毒 5 k b可可 感感 染染 分分 裂裂 和和 非非 分分 裂裂 细细 胞胞 ；整整 合合 到到 染染 色色 体体 中中 ；无无 致致 病病 性性 ； 免免 疫疫 原原 性性 弱弱 ；可可 长长 期期 表表 达达 外外 源源 基基 因因 ；在在 骨骨 骼骼 肌肌 、 心心 肌肌 、 肝肝 脏脏 、 视视网网 膜膜 等等 组组 织织 中中 表表 达达 较较 高高 ；In v i

21、v o 基基因因治治疗疗 ；E x v iv o 基基 因因 治治 疗疗 ；遗遗 传传 病病 基基 因因 治治 疗疗 ；获获 得得 性性 慢慢 性性 疾疾 病病 的的基基 因因 治治 疗疗 。H S V 病病 毒毒 载载 体体 双双 链链D N A 病病 毒毒 1 5 2 k b具具 有有 嗜嗜 神神 经经 性性 ； 可可 逆逆 轴轴 突突 传传递递 ；可可 潜潜 伏伏 感感 染染 ；容容 量量 大大 ；可可 感感 染染 分分 裂裂 和和 非非 分分 裂裂 细细 胞胞 ；神神 经经 系系 统统 疾疾 病病 的的 基基因因 治治 疗疗 ；肿肿 瘤瘤 的的 基基 因因 治治 疗疗 。常用的病毒载体

22、的特点：常用的病毒载体的特点：54 Ti质粒质粒是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌细胞是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤产生冠瘿瘤(grown gall tumors)。 致毒区 Ti 质粒复制起始点 冠瘿碱代谢 酶编码基因 与 Ti 质粒转移功能 有关的遗传座位 冠瘿碱合成基因 T-DNA 区 右边界 生长素合成基因 细胞分裂素合成基因 左边界 Ti 质粒。质粒。 Ti质粒的一部分质粒的一部分DNA叫做叫做转移转移DNA（T-DNA），当），当T-DNA整合到宿整合到

23、宿主植物细胞的染色体后，就主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱合成冠瘿碱(opine),作为土壤作为土壤农杆菌的碳源和氮源农杆菌的碳源和氮源 。六、Ti质粒55（1）T-DNA区（区（transferred-DNA regions） T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上导入质粒上导入植物细胞的一段植物细胞的一段DNA。 T-DNA两端各有一段两端各有一段25bp的重复序列的重复序列(LB, RB)。 T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因，由于激素携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因，由于激素合成

24、基因使细胞处于不停的分裂状态，形成冠瘿瘤，不能合成基因使细胞处于不停的分裂状态，形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。进行细胞分化。Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。质粒改造后才能应用于植物的基因工程。 保留保留T-DNA两端的末端序列，然后用外源两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。56（2）Vir区（区（virolence region）Vir区段上的基因与区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够

25、使农杆菌表现出毒性，故称之为毒有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区性区。Vir区段总长度大约区段总长度大约35kb，由，由7个互补群组成，分别命个互补群组成，分别命名为名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和和VirH。（3）Con区区(regions encoding conjugations) 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tratra），），调控调控TiTi质粒在农杆菌之间的转移。质粒在农杆菌之间的转移。 （4）Ori区区(origin of replication) 该区段基因调控该区段基

26、因调控TiTi质粒的自我复制，故称之为质粒的自我复制，故称之为复制起始区复制起始区。57（1）双元载体系统（）双元载体系统（binary vector）具有两个质粒具有两个质粒穿梭质粒和穿梭质粒和Ti质粒。质粒。（2）共整合载体（）共整合载体（integrated vector）共整合载体系统包括在共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成区经上的激素合成区经过突变后的过突变后的Ti质粒和中间载体两部分。质粒和中间载体两部分。Ti质粒的衍生载体质粒的衍生载体58七、七、酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YACyeast artif

27、icial chromosome, YAC） 八、细菌人工染色体八、细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BACbacterial artificial chromosome, BAC） 动物病毒动物病毒DNADNA改造的载体改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）逆转录病毒）59 人基因组十分庞大，约含人基因组十分庞大，约含4 410109 9bpbp，建立建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（载体，酵母人工染色体（yeast artificia

28、l yeast artificial chromosome,YACchromosome,YAC）载体应运而生。载体应运而生。YACYAC含含有酵母染色体端粒（有酵母染色体端粒（telesometelesome）、）、着丝点着丝点( (centromerecentromere) )及复制起点等功能序列，可插及复制起点等功能序列，可插入长度达入长度达200-500kb200-500kb的外源的外源DNADNA，导入酵母导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要，成为人基因组研究计划的重要60正常酵母人工染色体含有：正常酵母人工染

29、色体含有：* 四膜虫端粒（四膜虫端粒（tel)* 酵母自主复制序列（酵母自主复制序列（ARS)* 酵母着丝点酵母着丝点 (CEN)酵母的选择标记酵母的选择标记 (TRP1、 URA1)YAC载体载体61BAC载体载体62Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are

30、 F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.6364PAC载体载体65四种

31、常用载体的比较* * 外源外源DNADNA如超过如超过10kb10kb，则重组质粒的转化率和则重组质粒的转化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低* * * 已有个别材料可用于此目的已有个别材料可用于此目的66 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNADNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40SV40（Simian Virus 40Simian Virus 40）、）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，逆转录