食品化学 蛋白质

1、Chapter 5 Protein本章提要本章提要重点：重点：蛋白质的变性及其对食品品质的影蛋白质的变性及其对食品品质的影响；蛋白质的功能性质及其在贮藏加工过响；蛋白质的功能性质及其在贮藏加工过程中的变化，以及食品加工条件对食品品程中的变化，以及食品加工条件对食品品质和营养性的影响；食品中蛋白质及氨基质和营养性的影响；食品中蛋白质及氨基酸的测定。酸的测定。难点：难点：蛋白质功能性质、蛋白质构象变化蛋白质功能性质、蛋白质构象变化对其性质的影响。对其性质的影响。5.1. 概述 Introduction1.蛋白质在食品加工中的意义蛋白质在食品加工中的意义蛋白质是食品中三大营养素之一蛋白质是食品中三大

2、营养素之一蛋白质对食品的色、香、味及组织结构等蛋白质对食品的色、香、味及组织结构等具有重要意义具有重要意义一些蛋白质具有生物活性功能，是开发功一些蛋白质具有生物活性功能，是开发功能性食品原料之一能性食品原料之一2.2.蛋白质的分子量及其测定方法蛋白质的分子量及其测定方法分子量：分子量：一万到一百万道尔顿（一万到一百万道尔顿（Dalton)之间或之间或更大更大 测定方法测定方法: 渗透压法渗透压法 超离心法超离心法 凝胶过滤法凝胶过滤法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法3. 3. 蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成The elements of proteinC：50-55%H：6-8%O

3、：20-23%S：0-4%N：15-18%微量元素：微量元素：P、Fe、Zn、Cu、I 等。等。4. 4. 蛋白质的分类蛋白质的分类The classification of protein按分子形状分按分子形状分 纤维状蛋白质纤维状蛋白质 球状蛋白质球状蛋白质按分子组成分按分子组成分 简单蛋白质简单蛋白质 结合蛋白质结合蛋白质 清蛋白（溶于水、稀盐、稀酸、稀碱）清蛋白（溶于水、稀盐、稀酸、稀碱） 球蛋白（不溶于水、溶于稀盐、稀酸、稀碱）球蛋白（不溶于水、溶于稀盐、稀酸、稀碱） 谷蛋白（不溶于水、盐、溶于稀酸、稀碱）谷蛋白（不溶于水、盐、溶于稀酸、稀碱） 简单蛋白质简单蛋白质 醇溶蛋白（溶于醇

4、溶蛋白（溶于70-80乙醇、稀酸、稀碱）乙醇、稀酸、稀碱）（按蛋白质的溶解度分（按蛋白质的溶解度分 ） 组蛋白（溶于水、稀酸、稀氨水沉淀）组蛋白（溶于水、稀酸、稀氨水沉淀） 鱼精蛋白（溶于水、稀酸、氨水沉淀）鱼精蛋白（溶于水、稀酸、氨水沉淀） 硬蛋白（不溶于水、稀盐、稀酸、稀碱）硬蛋白（不溶于水、稀盐、稀酸、稀碱） 结合蛋白质结合蛋白质 核蛋白核蛋白 脂蛋白脂蛋白 糖蛋白糖蛋白 磷蛋白磷蛋白 血红蛋白血红蛋白 黄素蛋白黄素蛋白 金属蛋白金属蛋白 根据生物功能分根据生物功能分 酶酶 运输蛋白质运输蛋白质 营养和贮存蛋白质营养和贮存蛋白质 收缩蛋白质或运动蛋白质收缩蛋白质或运动蛋白质 结构蛋白质结

5、构蛋白质 防御蛋白质防御蛋白质 5.5.食品中蛋白质来源食品中蛋白质来源The source of protein in food动物蛋白质动物蛋白质: 如猪肉、鱼肉、鸡肉、乳如猪肉、鱼肉、鸡肉、乳植物蛋白质：如大豆、谷物植物蛋白质：如大豆、谷物微生物蛋白质：酵母微生物蛋白质：酵母氨基酸的一般性质氨基酸的一般性质General Properties of Amino AcidsCCCH2OHHHOHOCCCH2OHOHHHOD 甘 油 醛L 甘 油 醛CCCH2OHHHOHOCCCH2OHOHHHOD 甘 油 醛L 甘 油 醛NH2NH2 R R D-氨基酸氨基酸 L氨基酸氨基酸 氨基酸的氨基

6、酸的D-D-、L-L-构型是跟据甘油醛的构型命名的，构型是跟据甘油醛的构型命名的，而不是根据旋光性。大多数而不是根据旋光性。大多数L-L-氨基酸是右旋的。氨基酸是右旋的。(2)分类分类classification按按R R的极的极性分类性分类非极性氨基酸：非极性氨基酸：Ala丙丙,Ile异亮异亮,Leu亮亮,Phe苯丙苯丙,Met甲硫甲硫, Trp色色,Val,缬缬Pro脯 极性氨基酸极性氨基酸无电荷侧链氨基酸无电荷侧链氨基酸: :Ser（丝）（丝）,Thr（苏）（苏）,Tyr（酪）（酪）,Asn,Gln,Cys（半胱）（半胱）,Gly（甘）（甘）带正电荷侧链氨基酸带正电荷侧链氨基酸: :Ly

7、s（赖）（赖）,Arg（精）（精）,His（组）（组）带负电荷侧链氨基酸带负电荷侧链氨基酸: :Asp（天冬）（天冬）,Glu（谷）（谷） 天然蛋白质中含有天然蛋白质中含有20种氨基酸，仅含种氨基酸，仅含L氨基酸。其氨基酸。其中有中有8种必需氨基酸。（种必需氨基酸。（苯、蛋；赖、苏、色、亮、异亮、苯、蛋；赖、苏、色、亮、异亮、缬）缬）“笨蛋来宿舍凉一凉鞋笨蛋来宿舍凉一凉鞋”(3)(3)氨基酸在水中的溶解度氨基酸在水中的溶解度(4)(4)氨基酸的酸碱性质氨基酸的酸碱性质Acid-base properties of amino acids氨基酸在氨基酸在pH=7时水中存在形式时水中存在形式:氨基

8、酸是酸氨基酸是酸氨基酸是碱氨基酸是碱氨基酸的等电点（氨基酸的等电点（pIpI of amino acids of amino acids）的估算：）的估算： 是指氨基酸在溶液中净电荷为零时的是指氨基酸在溶液中净电荷为零时的pHpH值。值。当用酸滴定时：当用酸滴定时：(5)(5)氨基酸的疏水性氨基酸的疏水性Hydrophobic properties of Amino Acids疏水性概念：疏水性概念： 氨基酸以及肽和蛋白质的疏水程度可以氨基酸以及肽和蛋白质的疏水程度可以根据氨基酸在水和弱极性溶剂例如乙醇中根据氨基酸在水和弱极性溶剂例如乙醇中的相对溶解度来确定，将的相对溶解度来确定，将1mol

9、1mol 氨基酸从氨基酸从水溶液中转移到乙醇溶液中，自由能的变水溶液中转移到乙醇溶液中，自由能的变化化( (即转移自由能即转移自由能) )来计算。来计算。氨基酸的疏水性氨基酸的疏水性是指氨基酸从乙醇转移至水是指氨基酸从乙醇转移至水中的自由能变化中的自由能变化(6)氨基酸的光学性质及光谱氨基酸的光学性质及光谱Optical properties of amino acids 氨基酸具有氨基酸具有旋光性旋光性（除甘氨酸（除甘氨酸) ) 立体异构体：立体异构体：L L、D D型，天然只存在型，天然只存在L L型异构体型异构体 =210nm,=210nm,氨基酸都有吸收峰氨基酸都有吸收峰 =278nm

10、,=278nm,色氨酸都有最大吸收峰色氨酸都有最大吸收峰 =274.5nm,=274.5nm,酪氨酸都有最大吸收峰酪氨酸都有最大吸收峰 =260.0nm,=260.0nm,苯丙氨酸都有最大吸收峰苯丙氨酸都有最大吸收峰(7)氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应Chemical reactions of amino acids 羧酸性质：羧酸性质：成盐、成酯、成酰胺、脱羧、酰氯化成盐、成酯、成酰胺、脱羧、酰氯化 氨基性质氨基性质：与：与HClHCl结合、脱氨、与结合、脱氨、与HNOHNO3 3作用作用其他性质：其他性质：a a）与茚三酮反应）与茚三酮反应440nm440nm时呈黄色，测定时呈黄色，测定

11、脯氨酸和羟脯氨酸脯氨酸和羟脯氨酸；570nm570nm时呈蓝色或紫色，测定时呈蓝色或紫色，测定其其它氨基酸它氨基酸。b b）与荧光胺反应与荧光胺反应 生成强荧光物质，可用于氨基酸、肽和蛋生成强荧光物质，可用于氨基酸、肽和蛋白质的快速定量。激发波长白质的快速定量。激发波长 390nm390nm，发射波长，发射波长475nm475nm。异吲哚衍生物异吲哚衍生物 强荧光强荧光c c）与邻苯二甲醛反应与邻苯二甲醛反应 生成生成强荧光异吲哚衍生物强荧光异吲哚衍生物，激发波长，激发波长 380nm380nm，发射波长发射波长450nm450nm。可用于氨基酸、肽和蛋白质的。可用于氨基酸、肽和蛋白质的定量分

12、析。定量分析。1 1、概述、概述（Introduction）(1)(1)、构象与构型的区别、构象与构型的区别、构型：、构型：是指原子的空间排列，这种排列的改变会是指原子的空间排列，这种排列的改变会涉及共价键的生成或破坏涉及共价键的生成或破坏，但与氢键无关。，但与氢键无关。如氨基酸的如氨基酸的D-D-型和型和L-L-型。型。 立体异构体包括光学立体异构体包括光学 异构体和结构异构体。异构体和结构异构体。 互为镜像互为镜像、构象、构象 构象是指分子内各原子或基团之间的立体关系。构象是指分子内各原子或基团之间的立体关系。构象的改变是由于氢键的旋转而产生的，他不涉构象的改变是由于氢键的旋转而产生的，他

13、不涉及共价键的变化，仅及共价键的变化，仅涉及到氢键等次级键的改变涉及到氢键等次级键的改变。 当单链旋转时，分子中的基团或原子可能形成当单链旋转时，分子中的基团或原子可能形成不同的空间排布，这些不同的空间排列称为不同不同的空间排布，这些不同的空间排列称为不同的构象。的构象。 为了避免构象和构型的混淆，为了避免构象和构型的混淆，19691969年年IUPACIUPAC规规定，在描述蛋白质等生物大分子的空间结构时使定，在描述蛋白质等生物大分子的空间结构时使用构象。用构象。（2）、稳定蛋白质构象的作用力）、稳定蛋白质构象的作用力氢键：氢键：某些侧链与主链骨架之间，如酪氨酸残基上的羟基某些侧链与主链骨架

14、之间，如酪氨酸残基上的羟基与主链骨架上的羰基之间。与主链骨架上的羰基之间。与水分子之间与水分子之间RNA酶中三个分离酶中三个分离的残基通过水桥联系的残基通过水桥联系起来。起来。 在两条多肽链之间或一条多肽链的不同部位之间，主链在两条多肽链之间或一条多肽链的不同部位之间，主链骨架上的骨架上的羰基氧原子与亚氨基氢原子羰基氧原子与亚氨基氢原子形成氢键形成氢键 在蛋白质的某些侧链之间，在蛋白质的某些侧链之间，例如酪氨酸残基上的羟基与例如酪氨酸残基上的羟基与谷氨酸残基或天门冬氨酸残基上的羧基之间可以形成氢键。谷氨酸残基或天门冬氨酸残基上的羧基之间可以形成氢键。疏水相互作用：疏水相互作用： 是指非极性基团

15、即疏水基团为了避开水相而群是指非极性基团即疏水基团为了避开水相而群集在一起的集合力。集在一起的集合力。 LeuLeu、IleIle、PhePhe、ValVal、TrpTrp、ProPro等氨基酸残基。等氨基酸残基。 40-6040-60左右：减弱。左右：减弱。范德华力范德华力: : 取向力；诱导力；色散力取向力；诱导力；色散力 特点：引力随作用基团之间距离的增大而特点：引力随作用基团之间距离的增大而迅速减小，但两个作用基团只互相吸引，并不迅速减小，但两个作用基团只互相吸引，并不相碰。相碰。离子相互作用：离子相互作用：是由带相反电荷的两个基团间的是由带相反电荷的两个基团间的静电吸引所形成。静电吸

16、引所形成。配位键：配位键：指在两个原子之间由其中一个原子单独指在两个原子之间由其中一个原子单独提供电子对而形成的一种特殊的共价键。提供电子对而形成的一种特殊的共价键。 金属离子与蛋白质之间。金属离子与蛋白质之间。二硫键：二硫键：两个硫原子之间形成的作用力。两个硫原子之间形成的作用力。 氢键、疏水相互作用、范德华力和离子相互作氢键、疏水相互作用、范德华力和离子相互作用用这四种次级键是维持和稳定蛋白质分子构象的主这四种次级键是维持和稳定蛋白质分子构象的主要作用力。在一些蛋白质分子中，要作用力。在一些蛋白质分子中，二硫键和配位键二硫键和配位键也参与维持和稳定蛋白质的三、四级结构。也参与维持和稳定蛋白

17、质的三、四级结构。2 2、蛋白质结构层次、蛋白质结构层次 一级结构一级结构 Primary Structure 二级结构二级结构 Secondary Structure 超二级结构超二级结构 Super secondary Structure 结构域结构域 Domain 三级结构三级结构 Tertiary Structure 四级结构四级结构 Quaternary Structure（1 1）、蛋白质分子一级结构）、蛋白质分子一级结构The primary structure of protein概念概念 又称化学结构，是指氨基酸在肽链中的排列顺序又称化学结构，是指氨基酸在肽链中的排列顺序及二

18、硫键的位置。及二硫键的位置。 肠促胰液肽和胰高血糖素肠促胰液肽和胰高血糖素含有含有2020100100个氨基酸残个氨基酸残基；多数含基；多数含100100500500个氨基酸残基；某些含几千个氨个氨基酸残基；某些含几千个氨基酸残基。基酸残基。肽键的结构肽键的结构肽单位结特征肽单位结特征肽键不同于肽键不同于C-NC-N单键和单键和C=NC=N双键；双键；肽键具有部分单键性质；肽键具有部分单键性质；肽键有双键性质不能自由旋转；肽键有双键性质不能自由旋转； 肽键键长肽键键长0.132nm0.132nm，比，比C-NC-N单键（单键（sp3sp3杂化，键杂化，键长长0.147nm0.147nm）短，比

19、）短，比C=NC=N双键（双键（sp2sp2杂化，键长杂化，键长0.1270.127）长，由此可见）长，由此可见肽键有双键性质不能自由肽键有双键性质不能自由旋转。旋转。肽单位是刚性平面结构肽单位是刚性平面结构 肽平面上的肽平面上的6 6个原子都位于同一个平面。个原子都位于同一个平面。称为酰氨平面。称为酰氨平面。两面角两面角（dihedral angledihedral angle）：）：, 一对两面角（一对两面角（， ）决定了相邻两个肽单）决定了相邻两个肽单位的相对位置。位的相对位置。肽单位平面有一定的键长和键角。肽单位平面有一定的键长和键角。（2 2）、蛋白质分子的二级结构）、蛋白质分子的二

20、级结构The secondary structure of protein概念概念 是指多肽链中彼此靠近的氨基酸残基之是指多肽链中彼此靠近的氨基酸残基之间由于氢键相互作用而形成的空间关系。间由于氢键相互作用而形成的空间关系。二级结构类型二级结构类型 -螺旋结构螺旋结构 -折叠结构折叠结构 -转角（发夹和转角（发夹和环）环） 三股螺旋无规卷曲三股螺旋无规卷曲A A、 螺旋结构（螺旋结构（Helical structure） 是指多肽链主链骨架围绕一个轴一圈一圈地是指多肽链主链骨架围绕一个轴一圈一圈地上升，从而形成一个螺旋式的构象。上升，从而形成一个螺旋式的构象。 在一段连续的肽单位中，如果所有的

21、在一段连续的肽单位中，如果所有的 碳碳原子其成对的二面角（原子其成对的二面角（ ， ）都分别取相同）都分别取相同的值，这一段连续的肽单位的构象一般是的值，这一段连续的肽单位的构象一般是 螺螺旋构象。旋构象。View of a right-handed alpha helix 螺旋结构螺旋结构特征：特征： 每一圈包含每一圈包含3.63.6个残基，螺个残基，螺 距距0.54nm,0.54nm,螺旋上升时，每个残基延螺旋螺旋上升时，每个残基延螺旋 旋转旋转100100 残基高残基高0.15nm,0.15nm,螺距半径螺距半径 0.23nm;0.23nm; 每一个每一个角为角为-57-57，每一个，每

22、一个 角为角为-47-47； 相邻螺旋之间形成链内氢键；相邻螺旋之间形成链内氢键； 氢键的取向与螺轴几乎平行。氢键的取向与螺轴几乎平行。侧链侧链R R对对-螺旋的影响：螺旋的影响：在多肽链上，连续存在带相同电荷极性基团的在多肽链上，连续存在带相同电荷极性基团的AAAA残基（残基（AspAsp，GluGlu，LysLys），则），则-螺旋不稳定。如螺旋不稳定。如果这些残基分散存在，就不影响果这些残基分散存在，就不影响-螺旋构象的稳螺旋构象的稳定性。定性。当当GlyGly残基在多肽链上连续存在时，则残基在多肽链上连续存在时，则-螺旋不螺旋不能形成。能形成。ProPro残基和羟脯氨基酸残基存在时，则

23、不能形成残基和羟脯氨基酸残基存在时，则不能形成-螺旋结构。螺旋结构。B B、- -折叠折叠 指两条或多条几乎完全伸展的多肽链靠链间指两条或多条几乎完全伸展的多肽链靠链间氢键连结而形成的锯齿状折叠构象。氢键连结而形成的锯齿状折叠构象。-折叠的特点：折叠的特点： -折叠是肽链或肽段的一种相当伸展的结构。折叠是肽链或肽段的一种相当伸展的结构。a a、在在- -折叠的构象中，若干条肽链或一条肽链的若折叠的构象中，若干条肽链或一条肽链的若干肽段平行排列，相邻主链骨架之间靠干肽段平行排列，相邻主链骨架之间靠氢键氢键来维系来维系（C=OC=OH-NH-N）。）。b b、为了在主链骨架之间形成最多氢键，避免相

24、邻侧为了在主链骨架之间形成最多氢键，避免相邻侧链间的空间障碍，锯齿状的主链骨架必须做一定的链间的空间障碍，锯齿状的主链骨架必须做一定的折叠折叠（ =139=139，=135=135 ）。）。c c、与原子相连的侧链与原子相连的侧链R R交替地位于片层的上方或下方，交替地位于片层的上方或下方，它们均与片层相垂直。它们均与片层相垂直。d d、-折叠包括折叠包括平行平行-折叠和反平行折叠和反平行- -折叠。折叠。 平行平行- -折叠：折叠：肽链或肽段的排列方向相同，都是从肽链或肽段的排列方向相同，都是从 氨基端到羧基端。氨基端到羧基端。反平行反平行- -折叠：折叠：肽链或肽段按正反方向交替的方式排列

25、，肽链或肽段按正反方向交替的方式排列，即肽链或肽段排列时，氨基端到羧基端的方向一顺一反。即肽链或肽段排列时，氨基端到羧基端的方向一顺一反。 - -折叠主要存在于纤维状蛋白和球状蛋白中。折叠主要存在于纤维状蛋白和球状蛋白中。纤维蛋白纤维蛋白：- -折叠折叠反平行型反平行型式存在，式存在， - -折叠的折叠的形成是依靠不同肽链之间的氢键。形成是依靠不同肽链之间的氢键。球蛋白球蛋白：平行和反平行近乎相等，平行和反平行近乎相等， - -折叠的形折叠的形成即可靠不同肽链之间的氢键，也可依靠同一肽成即可靠不同肽链之间的氢键，也可依靠同一肽链的不同部分之间的氢键。链的不同部分之间的氢键。C C、-转角：转角

26、： 在蛋白质分子中，肽链经常出现在蛋白质分子中，肽链经常出现180180的回折，的回折，回折部分就是回折部分就是-转角（也称回折转角（也称回折 、-弯曲或发夹弯曲或发夹结构）。结构）。 -转角有转角有3 3种类型，每种类型都有种类型，每种类型都有4 4个氨基酸残个氨基酸残基，弯曲处的第一个残基的基，弯曲处的第一个残基的羰基羰基和第四个残基的和第四个残基的氨氨基基之间形成氢键，产生一种不很稳定的环状结构。之间形成氢键，产生一种不很稳定的环状结构。 在在I I型型- -转角中，中间肽平面的转角中，中间肽平面的C=OC=O基氧原子与基氧原子与相邻两个残基的侧链相邻两个残基的侧链( (图中的图中的R

27、R2 2和和R R3 3) )呈反式位置；呈反式位置； 而而型型-转角中，它们都在同一侧。只有第三转角中，它们都在同一侧。只有第三个残基为甘氨酸即个残基为甘氨酸即R R3 3为氢原子为氢原子型才能存在。型才能存在。I I型型-转角构象转角构象型型-转角构象转角构象D D、超二级结构、超二级结构 是指二级结构的基本单位相互是指二级结构的基本单位相互聚集，形成有规律的二级结构的聚聚集，形成有规律的二级结构的聚集体。集体。 超二级结构是介于二级结构与超二级结构是介于二级结构与结构域之间的结构层次，并充当三结构域之间的结构层次，并充当三级结构的基本构件。级结构的基本构件。E E、胶原三股螺旋：、胶原三

28、股螺旋： 由三条肽链组成的三股螺旋。由三条肽链组成的三股螺旋。 每条肽链形成一股左手螺旋，每条肽链形成一股左手螺旋，三股左手螺旋绞合在一起形成一个三股左手螺旋绞合在一起形成一个右手的三股超螺旋，胶原三股螺旋右手的三股超螺旋，胶原三股螺旋结构实际上是一种三股超螺族结构。结构实际上是一种三股超螺族结构。 F F、结构域、结构域 二级结构和超二级结构单元紧密相连，折叠成二级结构和超二级结构单元紧密相连，折叠成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠区两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠区域（通常为球状）域（通常为球状），如动物的免疫球蛋白，如动物的免疫球蛋白G(IgGG(IgG) )含有含有12

29、12个结构域。个结构域。 结构域与蛋白质亚基的区别：结构域与蛋白质亚基的区别：蛋白质分子间的结构蛋白质分子间的结构域以共价键连接。域以共价键连接。 残基：残基：4040400400个（个（100100200200常见）。常见）。 许多酶活性中心位于结构域之间的裂隙中。许多酶活性中心位于结构域之间的裂隙中。蛋白质分子的二级结构与一级结构的关系蛋白质分子的二级结构与一级结构的关系蛋白质的一级结构决定空间结构。蛋白质的一级结构决定空间结构。多肽链的二级结构是由蛋白质氨基酸顺序决定的，多肽链的二级结构是由蛋白质氨基酸顺序决定的，也可以说，可种氨基酸残基在形成二级结构时具也可以说，可种氨基酸残基在形成二

30、级结构时具有不同的倾向或能力。有不同的倾向或能力。从氨基酸残基顺序推测蛋白质二级结构区段。从氨基酸残基顺序推测蛋白质二级结构区段。处于折叠状态的蛋白质其空间结构是有多肽氨基处于折叠状态的蛋白质其空间结构是有多肽氨基酸序列所决定的。酸序列所决定的。（3 3）、三级结构）、三级结构 The tertiary structure of protein概念（概念（Concept ） 指多肽链在二级结构的基础上进一步折叠、指多肽链在二级结构的基础上进一步折叠、盘曲而形成特定的球状分子结构。盘曲而形成特定的球状分子结构。单链蛋白质：单链蛋白质：三级结构就是分子本身的特征立三级结构就是分子本身的特征立体结构

31、。体结构。多链蛋白质：多链蛋白质：三级结构是各组成链（亚基）的三级结构是各组成链（亚基）的主链和侧链的空间排布。主链和侧链的空间排布。结构结构特征特征 a a、在球状蛋白质在球状蛋白质分子中，一条多肽分子中，一条多肽链往往是通过一部链往往是通过一部分分-螺旋、一部螺旋、一部分分-折叠、一部折叠、一部分分-转角和一部转角和一部分无规则卷曲形成分无规则卷曲形成紧密的球状构象。紧密的球状构象。b b、在球状蛋白质分子中，大多数非极性侧链总是在球状蛋白质分子中，大多数非极性侧链总是埋在分子的内部，形成疏水核；而大多数极性侧链埋在分子的内部，形成疏水核；而大多数极性侧链总是暴露在分子的表面上，形成一亲水

32、区。总是暴露在分子的表面上，形成一亲水区。 极性基团的种类、数目与排布决定了蛋白质的功能。极性基团的种类、数目与排布决定了蛋白质的功能。c c、在蛋白质分子的表面，往往有一个内陷的空穴在蛋白质分子的表面，往往有一个内陷的空穴( (裂隙、凹槽、袋裂隙、凹槽、袋) )。此空穴往往是疏水区，能够容。此空穴往往是疏水区，能够容纳一个或两个小分子配体，或大分子配体的一部分。纳一个或两个小分子配体，或大分子配体的一部分。典型的蛋白质三级结构典型的蛋白质三级结构肌红蛋白的三级结构肌红蛋白的三级结构稳定三级结构的作用力稳定三级结构的作用力（4 4）、蛋白质分子的四级结构）、蛋白质分子的四级结构The quat

33、ernary structure of protein 、概念（、概念（Concept ） 由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合而成的具有特定三维结构的蛋白质构象叫做合而成的具有特定三维结构的蛋白质构象叫做蛋蛋白质四级结构。白质四级结构。血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构、蛋白质亚基：、蛋白质亚基：是一条多肽链。是一条多肽链。、寡聚蛋白质：、寡聚蛋白质：由少数亚基聚合而成的蛋白质由少数亚基聚合而成的蛋白质、多聚蛋白质：、多聚蛋白质：由几十个，甚至上千个亚基聚由几十个，甚至上千个亚基聚合而成的蛋白质。合而成的蛋白质。、四级结构的狭义定义：、四级结构的狭

34、义定义：是指寡聚蛋白质中的是指寡聚蛋白质中的亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用。互作用。、四级结构的广义定义：、四级结构的广义定义：由相同或不同球蛋白由相同或不同球蛋白分子所构成的聚合体。分子所构成的聚合体。1 1、蛋白质变性的概念、蛋白质变性的概念The concept of protein denaturation蛋白质变性定义：蛋白质变性定义： 由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化，

35、不包括一级结以及物理、化学性质的异常变化，不包括一级结构上肽键的断裂。构上肽键的断裂。蛋白质变性本质：蛋白质变性本质： 蛋白质分子次级键的破坏引起的二级、三级、蛋白质分子次级键的破坏引起的二级、三级、四级结构的变化。四级结构的变化。 变性后的蛋白质称为变性蛋白质。变性后的蛋白质称为变性蛋白质。2 2、蛋白质变性对其结构和功能的影响、蛋白质变性对其结构和功能的影响物理性质的改变物理性质的改变 凝集、沉淀（凝集、沉淀（由于疏水基团暴露在分子表由于疏水基团暴露在分子表 面，引起溶解度降低）面，引起溶解度降低） 流动双折射流动双折射 粘度增加粘度增加 旋光值改变旋光值改变 紫外、荧光光谱发生变化紫外、

36、荧光光谱发生变化 改变对水结合的能力。改变对水结合的能力。 不能结晶。不能结晶。化学性质的改变化学性质的改变 酶水解速度增加酶水解速度增加（由于肽键的暴露，容易受到蛋由于肽键的暴露，容易受到蛋 白酶的攻击，使之增加了蛋白质对酶水解白酶的攻击，使之增加了蛋白质对酶水解 的敏感性。）的敏感性。） 分子内部基团暴露分子内部基团暴露生物性能的改变生物性能的改变 抗原性改变抗原性改变 生物功能丧失（失去酶活或免疫活性）生物功能丧失（失去酶活或免疫活性）3 3、可逆变性、可逆变性 Conformational adaptability of protein 除去变性因素之后，在适当的条件下蛋白质除去变性因

37、素之后，在适当的条件下蛋白质构象可以由变性态恢复到天然态。构象可以由变性态恢复到天然态。 如如: :核糖核酸酶用核糖核酸酶用8mol/L8mol/L的尿素和的尿素和巯基乙醇巯基乙醇作用时，由于分子中的二硫键被还原，酶的空间作用时，由于分子中的二硫键被还原，酶的空间结构也随之破坏，酶即变性失活。但是，用透析结构也随之破坏，酶即变性失活。但是，用透析法除去这些试剂后，变性的酶蛋白质就自动氧化法除去这些试剂后，变性的酶蛋白质就自动氧化恢复原来的空间结构，酶的活性也随之恢复。恢复原来的空间结构，酶的活性也随之恢复。4 4、 不可逆变性不可逆变性The protein denaturation 除去变性

38、因素之后，在适当的条件下除去变性因素之后，在适当的条件下蛋白质构象由变性态不能恢复到天然态。蛋白质构象由变性态不能恢复到天然态。 如：鸡蛋，大豆蛋白质。如：鸡蛋，大豆蛋白质。5 5、蛋白质变性测定方法、蛋白质变性测定方法The methods of determination on protein denaturation测定蛋白质的比活性测定蛋白质的比活性以天然蛋白质作对照，测定蛋白质物理以天然蛋白质作对照，测定蛋白质物理性质的变化。性质的变化。测定蛋白质化学性质的变化测定蛋白质化学性质的变化观察蛋白质的溶解度变化观察蛋白质的溶解度变化测定蛋白质的抗原性是否改变测定蛋白质的抗原性是否改变6

39、6、 影响蛋白质变性的因素影响蛋白质变性的因素The factors affecting denaturation物理因素物理因素 化学因素化学因素温度（热、低温）温度（热、低温） 酸碱酸碱机械处理（剪切）机械处理（剪切） 金属和盐金属和盐液压液压 有机溶剂有机溶剂辐射辐射 尿素和胍盐尿素和胍盐界面界面 表面活性剂表面活性剂 还原剂还原剂 A A、物理因素、物理因素（1 1）热变性）热变性伴随热变性，蛋白质的伸展程度相当大。例如，伴随热变性，蛋白质的伸展程度相当大。例如，天然血清清蛋白分子是椭圆形的，长、宽比为天然血清清蛋白分子是椭圆形的，长、宽比为3 3：1 1，经过热变性后变为，经过热变性

40、后变为5 5：5 5。变性速率取决于温度，当温度上升变性速率取决于温度，当温度上升1010，速率可，速率可增加增加600600倍左右。倍左右。热变性的敏感性取决于多种因素：蛋白质的性质、热变性的敏感性取决于多种因素：蛋白质的性质、蛋白质浓度、水活性、蛋白质浓度、水活性、pHpH、离子强度和离子种类。、离子强度和离子种类。蛋白质在有水存在时易变性。蛋白质在有水存在时易变性。 热变性产生的其他影响：热变性产生的其他影响：二硫键的断裂有时会释放出硫化氢。二硫键的断裂有时会释放出硫化氢。丝氨酸脱水，或谷氨酰胺和天冬酰胺的脱丝氨酸脱水，或谷氨酰胺和天冬酰胺的脱 氨反应。氨反应。在分子内或分子间形成新的共

41、价交联键，在分子内或分子间形成新的共价交联键，如如-谷氨酰基谷氨酰基-N-N-赖氨酸）。赖氨酸）。熔化温度熔化温度Tm Tm 或变性温度或变性温度TdTd： 蛋白质溶液在逐渐加热到临界温度以上时，蛋白质溶液在逐渐加热到临界温度以上时，蛋白质的构象从天然状态到变性状态有一个显著蛋白质的构象从天然状态到变性状态有一个显著地转变，这个转变的中点温度称为熔化温度地转变，这个转变的中点温度称为熔化温度Tm Tm 或或变性温度变性温度TdTd。 此时天然状态与变性状态浓度比为此时天然状态与变性状态浓度比为1 1。氨基酸的组成对蛋白质的热稳定性影响氨基酸的组成对蛋白质的热稳定性影响含有较多疏水氨基酸残基（尤

42、其是缬氨酸，异亮氨含有较多疏水氨基酸残基（尤其是缬氨酸，异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸）的蛋白质，对热的稳定性酸、亮氨酸和苯丙氨酸）的蛋白质，对热的稳定性高于亲水性较强的蛋白质。高于亲水性较强的蛋白质。天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸和酪氨酸的残基百分数与热变性温度呈正相色氨酸和酪氨酸的残基百分数与热变性温度呈正相关（关（r=0.98r=0.98）。）。丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、缬丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸的残基百分数则是与热变性温度呈负氨酸等氨基酸的残基百分数则是与热变性温度呈负相关（相关

43、（r=r=0.9750.975）。）。其他氨基酸对蛋白质的其他氨基酸对蛋白质的TdTd影响甚少。影响甚少。蛋白质的立体结构对热稳定性影响蛋白质的立体结构对热稳定性影响 单体球状蛋白在大多数情况下热变性是可单体球状蛋白在大多数情况下热变性是可逆的，许多单体酶加热到变性温度以上，甚至逆的，许多单体酶加热到变性温度以上，甚至在在100100短时间保留，然后立即冷却至室温，短时间保留，然后立即冷却至室温，它们也能完全恢复原有活性。而有的蛋白质在它们也能完全恢复原有活性。而有的蛋白质在9090100100加热较长时间，则发生不可逆变性。加热较长时间，则发生不可逆变性。水对蛋白质的热变性的影响水对蛋白质的

44、热变性的影响水能促进蛋白质的热变性。水能促进蛋白质的热变性。 在干燥状态，蛋白质具有一个静止的结构，多肽链序在干燥状态，蛋白质具有一个静止的结构，多肽链序列的运动受到了限制。列的运动受到了限制。 当向干燥蛋白质中添加水时，水渗透到蛋白质表面的当向干燥蛋白质中添加水时，水渗透到蛋白质表面的不规则空隙或进入蛋白质的小毛细管，并发生水合作用，不规则空隙或进入蛋白质的小毛细管，并发生水合作用，引起蛋白质溶胀。水的加入，增加了多肽链的淌度和分引起蛋白质溶胀。水的加入，增加了多肽链的淌度和分子的柔顺性，这时蛋白质分子处于动力学上更有利的熔子的柔顺性，这时蛋白质分子处于动力学上更有利的熔融结构。当加热时，蛋

45、白质的这种动力学柔顺性结构，融结构。当加热时，蛋白质的这种动力学柔顺性结构，相对于干燥状态，则可提供给水更多的几率接近盐桥和相对于干燥状态，则可提供给水更多的几率接近盐桥和肽链的氢键，结果肽链的氢键，结果Td Td 降低。降低。（2 2）低温）低温 某些蛋白质经过低温处理后发生可逆变性，某些蛋白质经过低温处理后发生可逆变性，例如有些酶（例如有些酶（L-L-苏氨酸脱氨酶）在室温下比较稳苏氨酸脱氨酶）在室温下比较稳定，而在定，而在00时不稳定。时不稳定。 某些蛋白质（某些蛋白质（11S 11S 大豆蛋白、麦醇溶蛋白、大豆蛋白、麦醇溶蛋白、卵蛋白和乳蛋白）在低温或冷冻时发生聚集和沉卵蛋白和乳蛋白）在

46、低温或冷冻时发生聚集和沉淀。当温度回升至室温，可再次溶解。淀。当温度回升至室温，可再次溶解。（3 3）机械处理）机械处理 揉捏、振动、挤压或搅打等高速机械揉捏、振动、挤压或搅打等高速机械剪切，都能引起蛋白质变性。剪切，都能引起蛋白质变性。 剪切速率愈高，蛋白质变性程度则愈大。剪切速率愈高，蛋白质变性程度则愈大。同时受到高温和高剪切力处理的蛋白质，则同时受到高温和高剪切力处理的蛋白质，则发生不可逆变性。发生不可逆变性。(4) (4) 静液压静液压热力学原因造成的蛋白质构象改变。热力学原因造成的蛋白质构象改变。不同于热变性，当压力很高时，一般在不同于热变性，当压力很高时，一般在2525即能即能发生

47、变性；而热变性需要在发生变性；而热变性需要在0.1M Pa 0.1M Pa 压力下，温压力下，温度为度为40408080范围才能发生变性。范围才能发生变性。光学性质表明大多数蛋白质在光学性质表明大多数蛋白质在1001001200MPa 1200MPa 压力压力范围作用下才会产生变性。范围作用下才会产生变性。蛋白质的柔顺性和可压缩性是压力诱导蛋白质变蛋白质的柔顺性和可压缩性是压力诱导蛋白质变性的主要原因。性的主要原因。静液压不易引起纤维状结构的蛋白质变性。静液压不易引起纤维状结构的蛋白质变性。 球状蛋白质因压力作用产生变性原因：球状蛋白质因压力作用产生变性原因：1)1) 蛋白质伸展而使空隙不复存

48、在；蛋白质伸展而使空隙不复存在；2)2) 非极性氨基酸残基因蛋白质的伸展而暴露，并非极性氨基酸残基因蛋白质的伸展而暴露，并产生水合作用。产生水合作用。 压力引起的蛋白质变性是高度可逆的，比如酶。压力引起的蛋白质变性是高度可逆的，比如酶。 高压加工不同于热加工，它不会损害蛋白高压加工不同于热加工，它不会损害蛋白质中的必需氨基酸和天然色泽和风味，也不会质中的必需氨基酸和天然色泽和风味，也不会导致有毒化合物的生成。导致有毒化合物的生成。（5 5）辐射）辐射因波长和能量大小而异。因波长和能量大小而异。紫外辐射可被芳香族氨基酸残基紫外辐射可被芳香族氨基酸残基( (色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸和

49、苯丙氨酸) )所吸收，导致蛋白质构象的改变，如所吸收，导致蛋白质构象的改变，如果能量水平很高，还可使二硫交联键断裂。果能量水平很高，还可使二硫交联键断裂。辐射和其他电离辐射能改变蛋白质的构象，同时辐射和其他电离辐射能改变蛋白质的构象，同时还会氧化氨基酸残基、使共价键断裂、离子化、形还会氧化氨基酸残基、使共价键断裂、离子化、形成蛋白质自由基、重组、聚合，这些反应大多通过成蛋白质自由基、重组、聚合，这些反应大多通过水的辐解作用传递。水的辐解作用传递。（6 6）界面）界面 在水和空气，水和非水溶液或固相等界面吸在水和空气，水和非水溶液或固相等界面吸附的蛋白质分子，一般发生不可逆变性。附的蛋白质分子，

50、一般发生不可逆变性。 蛋白质大分子向界面扩散并开始变性，在这一蛋白质大分子向界面扩散并开始变性，在这一过程中，蛋白质可能与界面高能水分子相互作用，过程中，蛋白质可能与界面高能水分子相互作用，许多蛋白质许多蛋白质- -蛋白质之间的氢键将同时遭到破坏，蛋白质之间的氢键将同时遭到破坏，使结构发生使结构发生“微伸展微伸展”。 由于许多疏水基团和水相接触，使部分伸展的由于许多疏水基团和水相接触，使部分伸展的蛋白质被水化和活化，处于不稳定状态。蛋白质蛋白质被水化和活化，处于不稳定状态。蛋白质在界面进一步伸展和扩展，亲水和疏水残基力图在界面进一步伸展和扩展，亲水和疏水残基力图分别在水相和非水相中取向，因此界

51、面吸附引起分别在水相和非水相中取向，因此界面吸附引起蛋白质变性，某些主要靠二硫交联键稳定其结构蛋白质变性，某些主要靠二硫交联键稳定其结构的蛋白质不易被界面吸附。的蛋白质不易被界面吸附。B B、化学因素、化学因素1.pH1.pH 蛋白质所处介质的蛋白质所处介质的pH pH 对变性过程有很大的对变性过程有很大的影响，蛋白质在等电点时最稳定，溶解度最低，影响，蛋白质在等电点时最稳定，溶解度最低，在中性在中性pH pH 环境中，除少数几个蛋白质带有正电环境中，除少数几个蛋白质带有正电荷外，大多数蛋白质都带有负电荷。荷外，大多数蛋白质都带有负电荷。 蛋白质分子在极端碱性蛋白质分子在极端碱性pHpH环境下

52、，比在极端环境下，比在极端酸性酸性pHpH时更易伸长，因为碱性条件有利于部分埋时更易伸长，因为碱性条件有利于部分埋藏在蛋白质分子内的羧基、酚羟基、巯基离子化，藏在蛋白质分子内的羧基、酚羟基、巯基离子化，结果使多肽链拆开，离子化基团自身暴露在水环结果使多肽链拆开，离子化基团自身暴露在水环境中。境中。 pH pH 引起的变性大多数是可逆的，在某些情引起的变性大多数是可逆的，在某些情况下，部分肽键水解，天冬酰胺、谷氨酰胺脱酰况下，部分肽键水解，天冬酰胺、谷氨酰胺脱酰胺，碱性条件下二硫键的破坏，或者聚集等都将胺，碱性条件下二硫键的破坏，或者聚集等都将引起蛋白质不可逆变性。引起蛋白质不可逆变性。2 2金

53、属金属 碱金属碱金属( (例如例如NaNa+ +和和K K+ +) )只能有限度地与蛋白只能有限度地与蛋白质起作用，而质起作用，而CaCa2+2+、MgMg2+2+略微活泼些。过渡金属例略微活泼些。过渡金属例如如CuCu、FeFe、HgHg和和AgAg等离子很容易与蛋白质发生作等离子很容易与蛋白质发生作用，其中许多能与巯基形成稳定的复合物（牛奶用，其中许多能与巯基形成稳定的复合物（牛奶解毒）。解毒）。 CaCa2+2+( (还有还有FeFe2+2+、CuCu2+2+和和MgMg2+2+) )可成为某些蛋白可成为某些蛋白质分子或分子缔合物的组成部分。一般用透析法质分子或分子缔合物的组成部分。一般

54、用透析法或螯合剂可从蛋白质分子中除去金属离子，但这或螯合剂可从蛋白质分子中除去金属离子，但这将明显降低这类蛋白质对热和蛋白酶的稳定性。将明显降低这类蛋白质对热和蛋白酶的稳定性。3 3有机溶剂有机溶剂 改变介质的介电常数，从而使保持蛋白质稳改变介质的介电常数，从而使保持蛋白质稳定的静电作用力发生变化。定的静电作用力发生变化。 非极性有机溶剂渗入疏水区，可破坏疏水相互非极性有机溶剂渗入疏水区，可破坏疏水相互作用，促使蛋白质变性，这类溶剂的变性行为也作用，促使蛋白质变性，这类溶剂的变性行为也可能是因为它们和水产生相互作用引起的。可能是因为它们和水产生相互作用引起的。 某些溶剂例如某些溶剂例如2-2-

55、氯乙醇，能增加氯乙醇，能增加-螺旋构象螺旋构象的数量，这种作用也可看成是一种变性方式的数量，这种作用也可看成是一种变性方式( (二级，二级，三级和四级结构改变三级和四级结构改变) )，例如卵清蛋白在水溶液介，例如卵清蛋白在水溶液介质中有质中有3131的的-螺旋，而在螺旋，而在2-2-氯乙醇中达到氯乙醇中达到8585。4 4有机化合物水溶液有机化合物水溶液 某些有机化合物例如尿素和胍盐的高浓度某些有机化合物例如尿素和胍盐的高浓度(4(48mol/L)8mol/L)水溶液能断裂氢键，从而使蛋白质发生不水溶液能断裂氢键，从而使蛋白质发生不同程度的变性。同程度的变性。 同时，还可通过增大疏水氨基酸残基

56、在水相中同时，还可通过增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用。的溶解度，降低疏水相互作用。尿素和盐酸胍引起的变性包括两种机制：尿素和盐酸胍引起的变性包括两种机制： 第一种机制是变性蛋白质能与尿素和盐酸胍第一种机制是变性蛋白质能与尿素和盐酸胍优先结合，形成变性蛋白质优先结合，形成变性蛋白质- -变性剂复合物。变性剂复合物。 当复合物被除去，随着变性剂浓度的增加，天当复合物被除去，随着变性剂浓度的增加，天然状态的蛋白质不断转变为复合物，最终导致蛋然状态的蛋白质不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性。白质完全变性。 由于变性剂与变性蛋白的结合是非常弱的。因由于变性剂与变性蛋白的结合是

57、非常弱的。因此，只有高浓度的变性剂才能引起蛋白质完全变此，只有高浓度的变性剂才能引起蛋白质完全变性。性。 第二种机制是尿素与盐酸胍对疏水氨基第二种机制是尿素与盐酸胍对疏水氨基酸残基的增溶作用。酸残基的增溶作用。 因为尿素和盐酸胍具有形成氢键的能力，因为尿素和盐酸胍具有形成氢键的能力，当它们在高浓度时，可以破坏水的氢键结构，当它们在高浓度时，可以破坏水的氢键结构，结果尿素和盐酸胍就成为非极性残基的较好结果尿素和盐酸胍就成为非极性残基的较好溶剂，使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展溶剂，使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加。和溶解性增加。 尿素和盐酸胍引起的变性通常是可逆的，尿素和盐酸胍引起的

58、变性通常是可逆的，但是，在某些情况下，由于一部分尿素可以转变但是，在某些情况下，由于一部分尿素可以转变为氰酸盐和氨，而蛋白质的氨基能够与氰酸盐反为氰酸盐和氨，而蛋白质的氨基能够与氰酸盐反应改变了蛋白质的电荷分布。因此，尿素引起的应改变了蛋白质的电荷分布。因此，尿素引起的蛋白质变性有时很难完全复性。蛋白质变性有时很难完全复性。 还原剂（半胱氨酸、抗坏血酸、还原剂（半胱氨酸、抗坏血酸、-巯基乙巯基乙醇、二硫苏糖醇）可以还原二硫交联键，因而能醇、二硫苏糖醇）可以还原二硫交联键，因而能改变蛋白质的构象。改变蛋白质的构象。5.5.表面活性剂表面活性剂 表面活性剂例如十二烷基磺酸钠（表面活性剂例如十二烷基

59、磺酸钠（SDSSDS）是一）是一种很强的变性剂。种很强的变性剂。 SDS SDS 浓度在浓度在3 38m mol/L 8m mol/L 范围可引起大多数范围可引起大多数球状蛋白质变性。而且是不可逆变性。球状蛋白质变性。而且是不可逆变性。 由于由于SDS SDS 可以在蛋白质的疏水和亲水环境之可以在蛋白质的疏水和亲水环境之间起着乳化介质的介作用，且能优先与变性蛋白间起着乳化介质的介作用，且能优先与变性蛋白质强烈地结合，因此，破坏了蛋白质的疏水相互质强烈地结合，因此，破坏了蛋白质的疏水相互作用，促使天然蛋白质伸展，非极性基团暴露于作用，促使天然蛋白质伸展，非极性基团暴露于水介质中，导致了天然与变性

60、蛋白质之间的平衡水介质中，导致了天然与变性蛋白质之间的平衡移动。移动。6. 6. 盐盐 易溶盐对蛋白质稳定性的影响：易溶盐对蛋白质稳定性的影响：a)a) 在低盐浓度时，离子与蛋白质之间为非特异性静在低盐浓度时，离子与蛋白质之间为非特异性静电相互作用。当盐的异种电荷离子中和了蛋白质电相互作用。当盐的异种电荷离子中和了蛋白质的电荷时，有利于蛋白质的结构稳定，这种作用的电荷时，有利于蛋白质的结构稳定，这种作用与盐的性质无关，只依赖于离子强度。一般离子与盐的性质无关，只依赖于离子强度。一般离子强度强度0.2 0.2 时即可完全中和蛋白质的电荷。时即可完全中和蛋白质的电荷。b)b) 在较高浓度（在较高浓