基因敲除技术

1、Company nameCompany slogan here基因定点敲除技术Company nameCompany slogan here2概念基因敲除(knockout)技术是20世纪80年代发展起来的。是指一种遗传工程基因修饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。Company nameCompany slogan here31.锌指核酸酶(ZFNs)2.TALENs3.CRISPR-Cas9Company nameCompany slogan here4 1、锌指核酸酶(zin

2、c finger nuclease, ZFNs) 又名锌指蛋白核酸酶，不是自然存在的，而是一种人工改造的核酸内切酶(图1)，由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶赋剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。图1. 结合到DNA(橙色)上的锌指核酸酶(蓝色)，图片来自维基共享资源，Thomas SplettstoesserCompany nameCompany slogan here5结构Company nameCompany slogan here6 利用ZFNs进行基因打靶的试验步骤（1）确定ZFN靶位

3、点的DNA序列（2）设计和选择可识别靶位点的锌指蛋白( ZFPs)（3）利用已选择和设计的锌指蛋白组装ZFNs（4）单独将ZFNs转入正常细胞诱导目标基因发生DSB，则可激活NHEJ修复机制，或许将ZFNs和与目标基因同源的供体DNA一同转入正常细胞，则可以激活HR介导的DSB修复机制，并产生出变异群体（5）检测与研究供体DNA模板在特异位点所引起的基因变异与基因修复情况（6）还需要通过Southern杂交来检测供体DNA序列并没有整合到细胞基因组的其他位点Company nameCompany slogan here72005利用农杆菌介导转基因拟南芥的研究利用农杆菌介导转基因拟南芥的研究，

4、NHEJ修复修复ZFNs引起的引起的DSB在植物基因工程中应用的在植物基因工程中应用的可能性可能性2005Wright 等在烟草中利用ZFNsHR诱发DSB，证明了HR修复ZFNs引起的DSB在植物基因工程中应用的可能性2009Maeder等首先利用NHEJ修复了由ZFNs介导的烟草SurA和SurB的基因敲除 2009Townsend等利用HR修复机制对SurA和SurB的基因进行了操作2009Cai等利用ZFNs对烟草的CHN50基因进行了操作，他们利用HR介导的修复机制把PAT基因转入CHN50序列中 2009Shukla等利用HR修复通过插入PAT基因来敲除玉米的IPK1基因，得到了插

5、入PAT基 因并使CHN50基因敲除的玉米材料并研究了该基因敲除后的植物代谢表现2010Zhang等设计了针对ADH1和TT4的ZFNs，并构建了雌性激素诱导表达的载体系统 2010Osakabe设计了针对ABA-INSENSITIVE4( ABI4) 基因的ZFNs，并用农杆菌介导转入拟南芥植株，最终得到了ABI4基因敲除的纯合个体，具有对ABA和葡萄糖不敏感的表现型 2011Shaun等利用CoDA设计了8对ZFNs靶向操作大豆基因组中的独立基因与重复基因对 Company nameCompany slogan here8 锌指核酸酶ZFNs在植物基因组定点改造上的可能前景，但由于ZFNs

6、的合成组装技术难度大，一般实验室难以实施，而且ZFNs易于对基因组进行非特异性切割，或对靶点DNA切割效率低，一直限制其进入实际应用ZFNs的优缺点：的优缺点：Company nameCompany slogan here9 2009年，Boch等和Moscou等关于黄单胞菌效应子蛋白TAL效应子（transcription activator-like effector）与寄主靶基因DNA特异性识别分子密码的破解，使植物基因组定点改造呈现出新的曙光。 2011年8月来自Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALENs技术进行了基因组靶向修饰相关研究，并成

7、功敲除了人类细胞靶向基因和调控内源性基因的转录。 2013年，首尔国立大学化学系和国家基因工程创新举措研究中心的Kim课题组建立了一个全基因组规模的TALEN体系。他们系统地选取了人类基因组中高度特异性的序列作为靶点以避开脱靶效应。通过高通量克隆体系，一次性构建了近2万个编码蛋白基因的TALEN质粒。 2014年2月，北京大学生命科学学院魏文胜课题组依托于一种自主研发的TALE蛋白组装技术完成了全部TALE元件的解码工作。Company nameCompany slogan here102、TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向特异DNA序列的酶，它借助于TA

8、L效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。Company nameCompany slogan here11基因敲除步骤：（1）分析和确定待改良性状及其目标基因（2）针对目标基因DNA序列构建1对（或多对）TALENs表达基因盒，并将其装载入合适的植物表达载体。（3）利用农杆菌介导法等遗传转化途径，将TALENs表达基因盒导入目标植物细胞（4）分化获得转TALENs基因植株（5）对转基因植株

9、进行剪切位点的DNA序列分析及目标基因的表达分析（6）对转基因植株进行表型检测，包括目标基因性状和其它主要农艺性状（7）转基因植株通过自交或与其它材料杂交，筛选剔除转入的外源DNA片段、同时目标基因又得到修饰了的转基因植株（8）与常规育种技术结合，培育剔除不利性状基因或激活目标基因的植物新品种。Company nameCompany slogan here122011Mahfouz等将等将TAL效应子效应子Hax3的基因序列作了一些调整的基因序列作了一些调整，在拟南芥和烟草叶片中实验，证明，在拟南芥和烟草叶片中实验，证明TALENs能能够在植物体内特异性地对靶基因序列进行定点剪切。够在植物体内

10、特异性地对靶基因序列进行定点剪切。2011Cermak等通过拟南芥原生质体瞬时表达系统也证明TALENs在植物细胞内具有定点剪切功能。2012Yang Bing博士及其同事利用TALENs技术成功地将水稻感病基因Os11N3启动子序列定点切割使水稻白叶枯病原菌TAL效应子AvrXa7和PthXo3失去对Os11N3启动子靶点序列的识别，从而提高水稻的抗病能力。Company nameCompany slogan here13优势：(1)TALE的核酸识别单元与AGCT有恒定的对应关系(2)靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。(3)毒性低、脱靶情况少(4)成对的TA

11、LE识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。缺点:模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司Company nameCompany slogan here14结构Company nameCompany slogan here15优缺点： 相比于传统的锌指核酸酶(ZFNs)技术，TALENs具有独特的优势：设计更简单，特异性更高。缺点有：具有一定细胞毒性，模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司。Company nameCompany slogan here163.CRISPR-Cas9 2013 年 1 月份，美国两个实验室在Science杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基

12、因敲除的新方法，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9出现，它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。Company nameCompany slogan here17 CRISPR( Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats) /Cas( CRISPR-associated) 系统是一种广泛存在于细菌与古细菌中的，由R

13、NA介导的可遗传的获得性免疫系统，这种免疫系统为宿主细胞提供了对外源DNA( 如噬菌体质粒) 的免疫功能。 此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。Company nameCompany slogan here18Company nameCompany slogan here19第一步: 据靶序列设计RNA序列第二步: 根据自身需要选择sgRNA表达载体构建，或sgRNA体外转录合成第三步: 选择CRISPR/Cas9载体第四步：sgRNA活性检测第五步：稳定表达Cas9蛋白细胞株筛选操作步骤：Company nameCompany slogan here20CRISPR-Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术。相比于它的两位前辈ZFN系统和TALEN系统，它有着一些无可比拟的优点。首先，CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。