_第四讲__DNA和蛋白质技术与植物有效成分的提取(上课)

1、细胞内细胞内DNADNA复制与复制与PCRPCR技术的比较技术的比较细胞内细胞内DNA复制复制PCR不不同同点点解旋解旋在解旋酶作用下，边解旋在解旋酶作用下，边解旋边复制边复制80-100的温度范围内的温度范围内双链完全分开双链完全分开酶酶DNA解旋酶、解旋酶、DNA聚合聚合酶酶Taq DNA聚合酶聚合酶引物引物RNADNA或或RNA温度温度体内温和条件体内温和条件高温高温相相同同点点需提供需提供DNA复制的模板复制的模板四种脱氧核苷酸为原料；四种脱氧核苷酸为原料；子链延伸的方向都是从子链延伸的方向都是从5端到端到3端；端；1 1凝胶色谱法：也称分配色谱法，是根据凝胶色谱法：也称分配色谱法，是

2、根据 相对分子量大小分相对分子量大小分离蛋白质的方法。相对分子质量较小的移动速度较慢，而相对离蛋白质的方法。相对分子质量较小的移动速度较慢，而相对分子质量较大的无法进入凝胶内部，移动速度较快。分子质量较大的无法进入凝胶内部，移动速度较快。2 2缓冲溶液：能够抵制外界的缓冲溶液：能够抵制外界的 酸和碱对溶液酸和碱对溶液pHpH的影响，维持的影响，维持pHpH基本不变。基本不变。3 3电泳：带电粒子在电泳：带电粒子在 电场的作用下发生迁移的过程。电场的作用下发生迁移的过程。4 4样品处理：红细胞的洗涤样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放血红蛋白的释放分离血红蛋白分离血红蛋白溶液溶液透析。透析。5

3、5凝胶色谱操作：凝胶色谱柱的制作凝胶色谱操作：凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的填装凝胶色谱柱的填装样样品的加入和洗脱品的加入和洗脱 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。二、蛋白质的提取与分离二、蛋白质的提取与分离2.2.实验操作程序实验操作程序(1)(1)样品处理样品处理红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，以利于后续步骤的分红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，以利于后续步骤的分离纯化。离纯化。血红蛋白的释放：使红细胞涨破，血红蛋白释放出来。血红蛋白的释放：使红细胞涨破，血红蛋白释放出来。分离血红蛋白溶液：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开分离血红蛋白溶液：经过离心使血红蛋白和其他杂质分

4、离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。来，便于下一步对血红蛋白的纯化。(2)(2)粗分离粗分离透析：除去样品中相对分子量较小的杂质。取透析：除去样品中相对分子量较小的杂质。取1 1 mLmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL300 mL的的物质的量浓度为物质的量浓度为20 mmol20 mmol/L/L的磷酸缓冲液中的磷酸缓冲液中(pH(pH为为7.0)7.0)，透析，透析12 12 h h。(3)(3)纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。化。(4)(4)纯度鉴定：一般用

5、纯度鉴定：一般用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。提取提取方法方法水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法压榨法压榨法有机溶剂萃取法有机溶剂萃取法实验实验原理原理利用水蒸气将利用水蒸气将挥发性较强的挥发性较强的植物芳香油携植物芳香油携带出来带出来通过机械加压，压榨通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油出果皮中的芳香油使芳香油溶解在使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸有机溶剂中，蒸发溶剂获得芳香发溶剂获得芳香油油方法方法步骤步骤水蒸气蒸馏水蒸气蒸馏分离油层分离油层除水过滤除水过滤石灰水浸泡、漂洗石灰水浸泡、漂洗

6、压榨、过滤、静置压榨、过滤、静置再次过滤再次过滤粉碎、干燥粉碎、干燥萃取、过滤萃取、过滤浓缩浓缩三、植物有效成分的提取三、植物有效成分的提取提取提取方法方法水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法压榨法压榨法有机溶剂萃取法有机溶剂萃取法适用适用范围范围适用于提取玫瑰适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥油、薄荷油等挥发性强的芳香油发性强的芳香油适用于柑橘、柠适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料檬等易焦糊原料的提取的提取适用范围广，要求原适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有小，能充分浸泡在有机溶液中机溶液中优点优点简单易行，便于简单易行，便于分离分离生产成本低，易生产成本低，易保持原料原有的保

7、持原料原有的结构和功能结构和功能出油率高，易分离出油率高，易分离 局限局限性性水中蒸馏会导致水中蒸馏会导致原料焦糊和有效原料焦糊和有效成分水解等问题成分水解等问题分离较为困难，分离较为困难，出油率相对较低出油率相对较低使用的有机溶剂处理使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的不当会影响芳香油的质量质量 四、植物有效成分提取实例四、植物有效成分提取实例1 1（玫瑰精油的提取）（玫瑰精油的提取）1、提取方法：2 2、实验原理：、实验原理：3 3、实验装置：、实验装置：水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法利用水蒸气将利用水蒸气将挥发性较强挥发性较强的芳香油携带出来的芳香油携带出来水蒸气蒸馏装置水蒸气蒸馏装置（包括：

8、水中蒸馏法、水上（包括：水中蒸馏法、水上蒸馏法蒸馏法、水气蒸馏法）、水气蒸馏法）4 4、实验流程：、实验流程：鲜玫瑰花鲜玫瑰花+ + 清水清水水蒸气水蒸气蒸馏蒸馏油水油水混合物混合物（乳白色乳浊液）乳白色乳浊液）加加NaClNaCl目的：促进油水分层目的：促进油水分层用分液漏斗将两层分开用分液漏斗将两层分开分离分离油层油层加无水加无水NaNa2 2SOSO4 4除水除水玫瑰油玫瑰油1 1、玫瑰采摘期盛花期、玫瑰采摘期盛花期2 2、玫瑰花瓣：清水、玫瑰花瓣：清水=1:4=1:4水中蒸馏水中蒸馏过滤过滤除除NaNa2 2SOSO4 42、橘皮精油的提取具体操作步骤、橘皮精油的提取具体操作步骤1、橘

9、皮精油的主要成分：、橘皮精油的主要成分：柠檬烯柠檬烯（无色透明）（无色透明）石灰水浸泡石灰水浸泡静置静置过滤过滤压榨压榨漂洗漂洗再次过滤再次过滤：破坏细胞结构，分解果胶破坏细胞结构，分解果胶且防止滑脱且防止滑脱，提高出提高出油率油率。：流水漂洗后沥干水分流水漂洗后沥干水分：压榨时加入相当于橘皮压榨时加入相当于橘皮0.25%的的NaHCO3和和5%的的Na2SO4,并调节并调节PH至至78：先用普通：先用普通布袋过滤布袋过滤除去固体物和残渣，然后除去固体物和残渣，然后离离心心进一步除去质量较小的残留固体物进一步除去质量较小的残留固体物,再用再用分分夜漏斗或吸管夜漏斗或吸管将上层的橘皮油分离出来将

10、上层的橘皮油分离出来：静置：静置57d，吸管吸出上层澄清橘皮精油，吸管吸出上层澄清橘皮精油橘皮精油橘皮精油四、植物有效成分提取实例四、植物有效成分提取实例2 2（橘皮精油的提取）（橘皮精油的提取）根据碳碳双键的数目根据碳碳双键的数目-胡萝卜素胡萝卜素-胡萝卜素胡萝卜素-胡萝卜素胡萝卜素最主要组成成分最主要组成成分1、分类、分类2、理化性质、理化性质橘黄色橘黄色结晶，化学性质比较稳定，结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂3、工业上提取天然、工业上提取天然-胡萝卜素的方法胡萝卜素的方法植物植物大面积养殖的岩藻大面积养殖的岩

11、藻微生物的发酵生产微生物的发酵生产四、植物有效成分提取实例四、植物有效成分提取实例3 3（胡萝卜胡萝卜的提取）的提取）4、提取胡萝卜素的实验流程、提取胡萝卜素的实验流程(萃取法萃取法)胡萝卜胡萝卜粉碎粉碎干燥干燥萃取萃取过滤过滤浓缩浓缩胡萝卜素胡萝卜素一般在一般在60706070的烘箱中烘干的烘箱中烘干, ,时间约时间约1212小时小时1.1.萃取剂的选择萃取剂的选择有机溶剂水溶性有机溶剂水溶性有机溶剂水不溶性有机溶剂水不溶性有机溶剂如：乙醇和丙酮如：乙醇和丙酮如：石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、如：石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、四氯化碳等四氯化碳等请问请问:萃取胡萝卜素的有机溶剂应如何选择呢？萃取

12、胡萝卜素的有机溶剂应如何选择呢？ 沸点高沸点高,能充分溶解胡萝卜素能充分溶解胡萝卜素,且不与水混溶且不与水混溶. 对人体无毒性或毒性相对较小对人体无毒性或毒性相对较小 不易燃不易燃 易与产品分离，不影响产品质量易与产品分离，不影响产品质量2、萃取胡萝卜素的有机溶剂应具有的特点：、萃取胡萝卜素的有机溶剂应具有的特点：3.3.影响萃取效率的因素影响萃取效率的因素主要取决于萃取剂的性质和使用量主要取决于萃取剂的性质和使用量原料颗粒大小、紧密程度、含水量、萃取的温度原料颗粒大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间和时间一般颗粒小、萃取温度高、时间长一般颗粒小、萃取温度高、时间长萃取效果好萃取效果好胡萝

13、卜素提取装置胡萝卜素提取装置萃取萃取的步骤的步骤制备好的制备好的 胡萝卜干粉胡萝卜干粉萃取剂萃取剂 石油醚石油醚圆底烧瓶圆底烧瓶放入放入置于置于水浴装置水浴装置上部固定冷凝管上部固定冷凝管加热一段时间加热一段时间移去酒精灯移去酒精灯冷却冷却过滤：除去萃取液中不溶物过滤：除去萃取液中不溶物蒸馏：挥发萃取剂，蒸馏：挥发萃取剂，浓缩浓缩胡萝卜素提取液胡萝卜素提取液防止加热时防止加热时 有机溶剂的挥发有机溶剂的挥发避免明火加避免明火加热引起燃烧、热引起燃烧、爆炸爆炸蒸馏装置蒸馏装置萃取液的浓缩直接使用蒸馏装置萃取液的浓缩直接使用蒸馏装置5、结果分析与评价、结果分析与评价将提取的胡萝卜素粗品通过将提取的

14、胡萝卜素粗品通过纸层析纸层析进行鉴定进行鉴定如果如果萃取样品中出现了和标准样品一样的层萃取样品中出现了和标准样品一样的层析带析带，说明胡萝卜素的实验成功，说明胡萝卜素的实验成功由于提取物中含有由于提取物中含有杂质杂质，萃取样品的颜色可，萃取样品的颜色可能比标准样品的颜色能比标准样品的颜色浅浅，可以通过颜色的比，可以通过颜色的比较，初步确定提取的胡萝卜素的量较，初步确定提取的胡萝卜素的量制备滤纸条制备滤纸条( (量作基线量作基线 )：取取181830cm30cm滤纸条，于距底端滤纸条，于距底端2cm2cm处划基线，取处划基线，取ABCDABCD四个点。四个点。对照点样：对照点样： 用最细注射器针

15、头分别吸取用最细注射器针头分别吸取标准标准样品和样品和提取提取样样品在品在ADAD和和BCBC点样，点样，每次点样后用吹风机将溶剂每次点样后用吹风机将溶剂吹干吹干。干燥层析：干燥层析：滤纸干燥后，将滤纸卷成筒状并滤纸干燥后，将滤纸卷成筒状并固定固定，放，放到盛有到盛有1cm1cm深石油醚的深石油醚的密封容器中密封容器中层析。层析。对比观察：对比观察： 取出滤纸条，使石油醚充分挥发后观察取出滤纸条，使石油醚充分挥发后观察层析带层析带胡萝卜素的胡萝卜素的纸层析鉴定纸层析鉴定：纸层析法纸层析法比较本实验纸层析法和叶绿素的提取和分离纸层析法比较本实验纸层析法和叶绿素的提取和分离纸层析法1、目的不同：、

16、目的不同：本实验：本实验： -胡萝卜素粗品鉴定胡萝卜素粗品鉴定必修必修1 ：分离叶绿体中的色素：分离叶绿体中的色素2、对滤纸处理不同、对滤纸处理不同 本实验：底下不需要剪角本实验：底下不需要剪角 必修必修1： 底下剪去两角底下剪去两角3、点样不同、点样不同本实验：本实验： A、D点标准样品，点标准样品，B、C点提取样品点提取样品必修必修1：画滤液细线：画滤液细线4、结果不同、结果不同本实验：滤纸条上呈现本实验：滤纸条上呈现胡萝卜素胡萝卜素层析带和层析带和杂质杂质色素带色素带必修必修1：滤纸条上呈现：滤纸条上呈现四条四条颜色、宽度不同的色素带颜色、宽度不同的色素带 效果自评组合式设计效果自评组合

17、式设计 一、在小题集训中洞悉命题视角一、在小题集训中洞悉命题视角(1)DNA(1)DNA在不同浓度的在不同浓度的NaClNaCl溶液中溶解度不同，在溶液中溶解度不同，在0.14 0.14 mol/Lmol/L的的NaClNaCl溶液中溶解度最低。溶液中溶解度最低。 ( ( ) )(2)DNA(2)DNA不溶于冷酒精，可用酒精进一步提取不溶于冷酒精，可用酒精进一步提取DNADNA。( ( ) )(3)DNA(3)DNA与二苯胺溶液反应生成紫色物质。与二苯胺溶液反应生成紫色物质。 ( ( ) )(4)(4)利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量小的利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量小的先洗

18、脱出来。先洗脱出来。 ( ( ) )(5)(5)在电泳过程中，蛋白质分子的移动速度，与分子本身的在电泳过程中，蛋白质分子的移动速度，与分子本身的大小和形状无关，而与所带电荷的差异有关。大小和形状无关，而与所带电荷的差异有关。 ( ( ) )(6)(6)在在SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电泳迁移速率完全取聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电泳迁移速率完全取决于分子的大小。决于分子的大小。 ( ( ) )(7)DNA(7)DNA聚合酶只能从聚合酶只能从33端延伸端延伸DNADNA链，不能从头开始合成链，不能从头开始合成DNADNA。 ( ( ) )(8)(8)在在PCRPCR技术中，技术中，DNADNA的

19、合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的33端向端向55端延伸。端延伸。 ( ( ) )(9)(9)植物芳香油的提取方法有蒸馏、压榨和萃取等。植物芳香油的提取方法有蒸馏、压榨和萃取等。 ( ( ) )(10)(10)玫瑰精油的提取宜采用蒸馏法。玫瑰精油的提取宜采用蒸馏法。 ( ( ) )(11)(11)胡萝卜素的提取应用萃取法。胡萝卜素的提取应用萃取法。 ( ( ) )二、在回顾教材图表中强化学科能力二、在回顾教材图表中强化学科能力据玫瑰精油提取的实验流程示意图回据玫瑰精油提取的实验流程示意图回答问题：答问题：(1)玫瑰花瓣与清水的质量比为多少？玫瑰花瓣与清水的质量比为多少？答案：答案：1

20、4。(2)加入的加入的NaCl和无水和无水Na2SO4的作用的作用是什么？是什么？答案：答案：NaCl：促进油水混合物分离；：促进油水混合物分离；Na2SO4：吸水。：吸水。(3)玫瑰精油提取的方法是什么？玫瑰精油提取的方法是什么？答案：水蒸气蒸馏法。答案：水蒸气蒸馏法。 例例11下列关于下列关于DNADNA的粗提取实验和血红蛋白的提取的粗提取实验和血红蛋白的提取实验，叙述正确的是实验，叙述正确的是 ( () ) A A前者选择鸡血细胞作为材料较好，后者选择哺乳动前者选择鸡血细胞作为材料较好，后者选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料较好物成熟的红细胞作为实验材料较好 B B样品预处理时，前者静

21、置样品预处理时，前者静置1 1天处理除去上清液；后天处理除去上清液；后者需要加入清水，反复低速短时间离心洗涤，至上清液无者需要加入清水，反复低速短时间离心洗涤，至上清液无黄色黄色 C C在在DNADNA粗提取实验中，往粗提取实验中，往2 mol/L2 mol/L氯化钠溶液中加入氯化钠溶液中加入蒸馏水析出蒸馏水析出DNADNA时，应该缓慢加入，直到出现黏稠物为止时，应该缓慢加入，直到出现黏稠物为止 D D洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等等A 例例22(2013(2013徐州模拟徐州模拟) )PCRPCR是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的技术，下列有关片段的技术，下列有关PCRPCR过程的叙述，不正确的是过程的叙述，不正确的是( () ) A A变性过程中破坏的是变性过程中破坏的是DNADNA分子内碱基对之间的氢键分子内碱基对