迈浦生物-核酸提取实验基础

1、2016年2月11日目 录 1. 核酸的简介 2. 核酸的理化性质 3. 染色体的组成 4. DNA的变性和复性 5. DNA的高级结构 6. 与DNA复制有关的物质 7. 基因组DNA的提取. . 核酸的简介核酸的简介细胞内的细胞内的核酸核酸包括包括DNADNA与与RNARNA两种分子，均与蛋白质两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白。结合成核蛋白。真核生物的真核生物的DNADNA又有又有染色体染色体DNADNA与与细胞器细胞器DNADNA之分。前之分。前者为者为双链线性分子双链线性分子；后者；后者为为双链环状分子双链环状分子。除此之外，在原核生物中除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒还有双链

2、环状的质粒DNADNA；在非细胞型病毒颗粒内，在非细胞型病毒颗粒内，DNADNA的存在形式多种多样。的存在形式多种多样。极性化合物，极性化合物，溶于水溶于水，不溶于不溶于乙醇、氯仿乙醇、氯仿等有机溶剂，等有机溶剂，钠盐比游离核酸易溶于水。钠盐比游离核酸易溶于水。在酸性溶液中，在酸性溶液中，DNADNA、RNARNA易水解，在易水解，在中性或弱碱性中性或弱碱性溶液溶液中较稳定。中较稳定。天然状态的天然状态的DNA DNA 是以脱氧核糖核蛋白是以脱氧核糖核蛋白(DNP)(DNP)形式存在于形式存在于细胞核中。细胞核中。核酸的理化性质核酸的理化性质组蛋白： H1 H2A H2B H3 H4非组蛋白核

3、小体DNA蛋白质蛋白质染色体染色体1) DNA的变性和复性 变性（Denaturation) DNA双链的氢键断裂，最后完全变成单链的过程称为变性。 复性（Renaturation) 热变性的DNA缓慢冷却，单链恢复成双链。DNA的高级结构线状DNA形成的超螺旋环状DNA形成的超螺旋与PCR有关的物质1、底物：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP)。2、模板：单链或双链DNA。3、引物： 16-30 bp合成的寡核苷酸。4、DNA聚合酶： 耐热的DNA聚合酶。5、Mg2+： DNA聚合酶的激活剂。基因组基因组DNA的提取的提取硅质材料硅质材料 阴离子交换树脂阴离子交换树

4、脂 磁磁 珠珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。从而达到分离目的。根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：离心管硅质滤膜式提取离心管硅质滤膜式提取离心管磁珠吸附式提取离心管磁珠吸附式提取整版磁珠法提取整版磁珠法提取1.SDS ：十二烷基硫酸钠2.Tris：缓冲液3.EDTA 作用：细胞裂

5、解时PH值也能稳定作用：a. 溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性 作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。4.蛋白酶蛋白酶 K :作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。5.醋酸钠醋酸钠(pH=6.0) :1. 沉淀核酸，缩短乙醇沉淀的时间2. 提供单价阳离子。减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀， 6.无水无水乙醇乙醇1. 任意比和水相混溶，夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。2. 但是加其他比例的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其

6、用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。优点：1. 有效变性蛋白质； 2. 抑制了DNase的降解作用。缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分DNA8.苯酚苯酚：1.加速有机相与液相分层。2.去除DNA水溶液中残留的微量酚。1. 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。2. 有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。9.异戊醇：异戊醇：7.氯

7、仿氯仿： 经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。 用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA DNA 联结键已断，蛋白分子表面又联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNADNA溶于溶于水相。作为表面变性的酚水相。作为表面变性的酚 与与 氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约弊，酚的变

8、性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10101515的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNADNA，而氯仿的变，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNADNA。所以在。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。吸下层有机相使用异戊醇吸下层有机相使用异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。在抽提可以降低表面张力，从而减少气泡产生。在抽提DNADNA时，为了混合均时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气

9、泡会阻匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一要混匀彻底，二要用量足够。抽提过程中的泡沫产生。一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA DNA 造成破坏，造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会部分

10、打断大分子的实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会部分打断大分子的基因组基因组 DNADNA，但该破坏作用不会强烈到，但该破坏作用不会强烈到 DNA DNA 变成变成 10kb 10kb 以内的小片以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA DNA 的片段，大部分会大于的片段，大部分会大于 20kb20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR PCR 和酶切，都是完全适用和酶切，都是完全适用的。的。 经典的裂解液几乎都含有盐盐、去污剂去污剂和蛋白酶蛋白酶 。 盐盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 ，还包括抑制样品

11、中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 、维持核酸结构的稳定 等。 去污剂去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。 裂解体系中还可能加入蛋白酶蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。 目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质它杂质主要是盐的分离。主要是盐的分离。 核酸纯化醇沉淀时使用异丙醇或乙醇，乙醇沉淀的核酸纯核酸纯化醇沉淀时使用异丙醇或乙醇，乙醇沉淀的核酸纯度更高。度更高。 异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，贴

12、壁紧；乙醇沉淀的核酸比异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，贴壁紧；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动。异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，较蓬松，容易从壁上移动。异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。少量核酸用异丙醇沉淀但比较难洗涤。少量核酸用异丙醇沉淀 ，大量核酸用乙，大量核酸用乙醇沉淀醇沉淀 。 低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。大增加。 肝糖元、淀粉及粘肝糖元、淀粉及粘多糖多糖 蛋白质的除去蛋白质的除去 不同类型核酸的分不

13、同类型核酸的分离离 同类核酸的分离同类核酸的分离核酸中除杂质核酸中除杂质-肝糖元、淀粉及粘多糖肝糖元、淀粉及粘多糖 取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天，可使细胞内肝糖元大大减少。 加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。 在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。 以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。 核酸中除杂质核酸中除杂质-蛋白质的除去蛋白质的除去 加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。 氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。 苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶