DNA重组技术的基本工具

1、据据WTOWTO调查：调查：20042004年全世界因狂犬病致死人数约年全世界因狂犬病致死人数约5.55.5万人万人中国卫生部通报：中国卫生部通报：20042004年年月，狂犬病列法定报告月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。传染病死亡数之首。发病死亡率近发病死亡率近100%100% . .能产生狂犬病抗体蛋白能产生狂犬病抗体蛋白的转基因烟草的转基因烟草基因工程基因工程的概念基因工程的概念指按照人们的愿望，进行指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过严格的设计，并通过体外体外DNA重组重组转基转基因因DNA分子水分子水平平基因工程的别名基因工程的别名基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重

2、组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物概念分析：问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想想一想需要做哪些关键工作？需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )苏云金芽孢杆

3、菌苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因抗虫基因棉花细胞棉花细胞( (含抗虫基因含抗虫基因) )棉花植株棉花植株( (有抗虫特性有抗虫特性) )上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？重组重组DNADNA导入导入形成形成基因工程培育抗虫棉的简要过程基因工程培育抗虫棉的简要过程基因工程培育抗虫棉的关键步骤基因工程培育抗虫棉的关键步骤关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：形成重组形成重组DNADNA关键步骤三：关键步骤三：重组重组DNADNA导入受体导入受体( (棉花棉花) )细胞细胞1.1 DN

4、A重组技术的基本工具重组技术的基本工具关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：形成重组形成重组DNADNA关键步骤三：关键步骤三：重组重组DNADNA导入受体导入受体( (棉花棉花) )细胞细胞主要来源主要来源：2.种类与种类与命名命名：3.作用作用：4.作用结果：作用结果：主要是从主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来中分离纯化出来的一类酶。的一类酶。约约4000种种识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键。形成形成粘性末端或平末端粘性末端或平末端 现在已经从约现在已经从约30

5、0300种微生物中分离出约种微生物中分离出约40004000种种限制性内切酶限制性内切酶( (限制酶限制酶) )。粘质沙雷氏杆菌粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens练习：流感嗜血杆菌的练习：流感嗜血杆菌的d d菌株菌株( Haemophilus influenzae( Haemophilus influenzae d ) d )中先后分离到中先后分离到3 3种限制酶，则分种限制酶，则分别命名为别命名为: :Hind、Hind和和Hind能被限制性内切酶特能被限制性内切酶特异性识别的切割部位异性识别的切割部位都具有都具有回文序列回文序列：在切割部位，一条链在切割部位，一条链正向正

6、向读的碱基顺序与读的碱基顺序与另一条链另一条链反向反向读的顺读的顺序完全序完全一致一致。限制性核酸内切酶作用的是限制性核酸内切酶作用的是DNADNA分子中的什么键？分子中的什么键？磷酸二酯键磷酸二酯键即脱氧核糖、磷即脱氧核糖、磷酸之间的连接酸之间的连接 GP AP黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端平末端平末端平末端平末端限制酶DNA解旋酶区别切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键的磷酸二酯键将将DNADNA两条链的氢键两条链的氢键打开形成两条单链打开形成两条单链限制酶DNA水解酶区别切割切割特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列的磷酸二酯键的磷酸二酯键，形成片，形成片段的段的DNA.DN

7、A.切割磷酸二酯键，形成切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。单个的脱氧核苷酸。目的基因所在目的基因所在DNADNA片段片段载体载体DNADNA片段片段催化催化形成形成 Ecoli DNA连接酶连接酶 T4 DNA连接酶连接酶 可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNA连接酶或连接酶或T4DNA连接酶连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的

8、缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶连接连接DNADNA链链连接部位连接部位相同点相同点双链双链单链单链在两在两DNADNA片段之间形片段之间形成磷酸二酯键成磷酸二酯键将单个核苷酸加将单个核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的33末端的末端的羟基上，形成磷羟基上，形成磷酸二酯键酸二酯键都能形成磷酸二酯键都能形成磷酸二酯键二者都是蛋白质类化合物二者都是蛋白质类化合物尝试写出下列序列受尝试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端限制酶作用后的黏性末端CTTCATGAATTCCCTAA GAAGTACTTAAGGGATT 1

9、.作用：作用：2.条件条件：3.种类：种类：质粒质粒、噬菌体的衍生物和动植物噬菌体的衍生物和动植物病毒等。病毒等。将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入受体细胞。 有1多个限制酶切点对受体细胞无害使导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ 作为载体的必要条件作为载体的必要条件

10、:Go back质粒的特点：质粒的特点：1.1.是一种裸露的、结构是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟简单、独立于细菌拟核核DNADNA分子外并能分子外并能自自我复制我复制的小型的小型双链环双链环状状DNADNA分子。分子。能复制并带着插能复制并带着插入的目的基因一入的目的基因一起复制起复制有切割位点有切割位点有标记基因的存有标记基因的存在，将来可用含在，将来可用含青霉素的培养基青霉素的培养基鉴别。鉴别。基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性( (识别序列识别序列) )切开切开DNADNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNADNA

11、连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键种类种类E.coliDNAE.coliDNA连接酶连接酶T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶载体载体具备的具备的条件条件质粒、质粒、噬菌体衍生物、噬菌体衍生物、动植物病毒动植物病毒种类种类能自我复制能自我复制有一个或多个酶切割位点有一个或多个酶切割位点有标记基因有标记基因对受体细胞无害对受体细胞无害1)不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNA2）有关基因工程的叙述中，正确的是（）有关基因工程的叙述中，正确的是（ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的、所有的限制酶只能识别一种特定的 核苷酸序列核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的载体、