葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质、剖析

1、生物化学大实验生物化学大实验实验指导老师实验指导老师 张萍萍张萍萍 房伟房伟 袁璟袁璟 袁莉袁莉 2013-09生化实验生化实验 n实验一： Sephadex-G50层析法分离蓝葡聚糖-2000和重铬酸钾n实验二：植物基因组DNA的提取及分离纯化n实验三：植物基因组DNA的鉴定与分析n实验四：蛋白质的FPLC分离与定量测定 n实验五：SDS-PAGE测定蛋白质分子量n实验六：聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点分子生物学实验分子生物学实验 n实验七：质粒的小量抽提n实验八：质粒DNA的酶切及电泳鉴定n实验九：聚合酶链式反应技术n实验十： PCR产物的胶回收纯化n实验十一：大肠杆菌感受态

2、细胞的制备及质粒DNA的转化n实验十二：DNA的体外重组实验要求（1）实验前要预习相关的内容实验前要预习相关的内容，弄懂原理，了解实验的设计思路，找出实验操作的关键步骤，试剂的配制方法及用量，数据处理的方法等。（2）实验过程中，要认真，规范的操作。学会安排实验时间和实验顺序学会安排实验时间和实验顺序。如实记录实验中出现的现象和数据。（3）使用仪器时要按照说明书去做。发现故障应停止使用。节约试剂。公用试剂用完后，要及时放回原处。（4）实验报告要及时完成。报告上要注明实验日期及温度。在报告的结果讨中，对实验现象，结果和数据等可进行分析；也可对实验中遇到的问题及实验中需要改进的地方进行讨论。（5）一

3、般试剂都应用蒸馏水或无离子水试剂都应用蒸馏水或无离子水(即离子交换水即离子交换水)配制配制，有特殊要求的除外。（6）试剂试剂(特别是液体特别是液体)一经取出，不得放回原瓶一经取出，不得放回原瓶，以免因量器或药勺不清洁而沾污整瓶试剂。取固体试剂时，必须使用洁净干燥的药勺。（7）使用易燃、易爆、有腐蚀性甚至有毒的化学药品时应注意安全，必要时应戴手套，带口罩或防毒面罩，并在通风橱中进行。（8）实验纪律：不迟到和缺席。实验室的卫生要轮流值日。成绩评定成绩评定n平时成绩：考勤 实验技能测试和实验报告等 50 60% n期末理论考试： 50 40%l实验室：实验室： 207室室 209室室l领用仪器：领用

4、仪器： 211室室 袁莉袁莉实验 葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质张萍萍张萍萍一. 目的和要求n1. 掌握葡聚糖凝胶柱层析法的分离原理及基本操作技术: 装柱 平衡 加样 洗脱收集等步骤.n2. 了解Vt Ve Vo Vi Kd Kav等参数的含义.二二. .原理原理n凝胶层析（凝胶层析（gel chromatography）又称为凝）又称为凝胶过滤（胶过滤（gel filtration）、分子筛过滤）、分子筛过滤（molecular sieve filtration） 等。它是等。它是20世纪世纪60年代发展起来的一种层析技术。其年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用基本原理是利用被分离物质分

5、子大小不同及被分离物质分子大小不同及固固定相（凝胶）定相（凝胶）具有分子筛的特点具有分子筛的特点，将被分离物将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。n凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的分子将完全小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网并随着流动相的移动沿凝胶网眼

6、孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其动，其流程短、阻力小、流速快，流程短、阻力小、流速快，比小分子先比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于两者之间的分子，不完全渗入凝胶网眼两者之

7、间的分子，不完全渗入凝胶网眼，则居则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。开。分子筛效应的理论分子筛效应的理论nA A小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过；粒外面，在颗粒之间迅速通过；nB B(1)(1)蛋白质混合物上柱蛋白质混合物上柱 (2)(2)洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻在颗粒之外（子则被排阻在颗粒之外（3 3）小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始）小分子被

8、滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开分开 (4)(4)大小分子完全分开大小分子完全分开 (5)(5)大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。尚在行进中。 n本实验本实验 利用凝胶柱：利用凝胶柱：SephadexG-50柱层柱层析，以水为洗脱液，分离大分子的蓝葡析，以水为洗脱液，分离大分子的蓝葡聚糖聚糖-2000 （分子量（分子量200万）和小分子万）和小分子的重铬酸钾（分子量的重铬酸钾（分子量293）; 根据组分根据组分的颜色深浅绘制洗脱曲线的颜色深浅绘制洗脱曲线; 并利用洗脱并利用洗脱参数计算组分的分配系数。参数计算组分的分配系数。交联葡聚糖

9、凝胶（商品名为交联葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex)n这是由这是由葡萄糖的多聚物葡萄糖的多聚物与与1氯氯 2、3环环氧丙烷氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。环氧丙烷的比例（交联度）来控制。交联葡聚糖凝胶（商品名为交联葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex)n常以常以G10至至G200号码标记号码标记 G G： 反应凝胶的交联程度、膨胀程度等反应凝胶的交联程度、膨胀程度等 G G后面的数字是其吸水

10、量（毫升水后面的数字是其吸水量（毫升水/ /克干胶）克干胶）乘以乘以1010所得的值。所得的值。 如如G G2525即表示吸水量为即表示吸水量为2.5ml/1g2.5ml/1g干胶。干胶。 市售有市售有G G1010、G G2525、G G5050、G G7575、G G100100、G G150150、G G200200等型号。等型号。 G G7575以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶软胶。G G7575以下的称为以下的称为硬胶。硬胶。n一般说一般说Sephadex G - l015通常用于分离肽及通常用于分离肽及“脱盐脱盐”。

11、Sephadex G75200用以分离各类蛋白质。用以分离各类蛋白质。n 外水体积外水体积(Vo: outer volume) (Vo: outer volume) ： 指基质颗粒之间体积的总和指基质颗粒之间体积的总和. .n 内水体积内水体积(vi:inner volume) (vi:inner volume) ： 指基质颗粒内部体积的总和指基质颗粒内部体积的总和. .n 基质体积基质体积(Vg) (Vg) ： 指基质自身所具有的体积。指基质自身所具有的体积。 V V。、。、Vi Vi 和和 VgVg都是随着床体积和基质性质都是随着床体积和基质性质变化而变化的变化而变化的。n洗脱体积（洗脱体

12、积（VeVe）：指自加样到组分出现最大浓度）：指自加样到组分出现最大浓度（峰）时所流出的洗脱液体积。（峰）时所流出的洗脱液体积。n床体积床体积VtVt（total volume) total volume) ： 指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)(Vt)。 VtVt是基质的外水体积是基质的外水体积(Vo)(Vo)和内水体积和内水体积(Vi) (Vi) 以及自身体积以及自身体积(Vg)(Vg)的总和。的总和。 Vt = Vo + Vi + VgVt = Vo + Vi + Vg = Vo + Vi = Vo + Vi Vt的测定的测定:n Vt为柱床

13、体积，可用下式计算：为柱床体积，可用下式计算： Vt=(D/2)2 h 式中，式中，为常数为常数3.14，D为柱直径，为柱直径，h为凝为凝胶床的高度。胶床的高度。n在实验中在实验中, 如何测定如何测定Vt?n Ve 与 Vo Vi 之间的关系为:nVe = Vo + Kd Vi 其中: Kd-样品组分在流动相和固定相之间的分配系数. 也可视为 不同分子量组分在凝胶颗粒内部和外部的分配系数. 它只与被分离组分的分子量大小及凝胶颗粒孔径大小和凝胶颗粒间空隙有关;与柱的长短和粗细无关. Kd 可通过实验测定. 分配系数分配系数 Kd =Kd =（Ve Ve VoVo）/ Vi/ Vi nKd Kd

14、可以有下列几种情况：可以有下列几种情况：n(1)(1)当当Kd=OKd=O时，则时，则Ve=VoVe=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质物质( (全排阻全排阻) )，洗脱容积等于空隙容积，洗脱容积等于空隙容积( (组分组分I)I)。n(2)(2)当当Kd=1Kd=1时，时，Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi，即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗，即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱容积应为空隙容积与内容积之和脱容积应为空隙容积与内容积之和( (组分组分)。n(3)(3)当当0101时时,Ve=Vo+KdVi,Ve=Vo+KdVi,即表示组分不同大小可部分进

15、入凝即表示组分不同大小可部分进入凝胶颗粒内部胶颗粒内部( (组分组分II) II) n1有效分配系数有效分配系数KavKavn已知已知 Kd=（Ve-Vo）/Vi，将，将Vt-Vo代替代替Vi， 则则Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo） 即即 Ve=Vo+Kav（Vt-Vo）nKav与与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。度大的凝胶差别大。n在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点来，

16、这一点为凝胶层析法的特点 nVt = Vo + Vi+ Vg = Vo + Vi nKd =（Ve Vo）/ Vi n Ve = Vo + Kd VinKav = （ Ve Vo）/ （Vt Vo） n Ve = Vo + Kav（Vt-Vo）n层析柱（层析柱（120cm）；梯度混合仪；恒流）；梯度混合仪；恒流泵；部分收集器；连接管等泵；部分收集器；连接管等 n葡聚糖葡聚糖G-50（ SephadexG-50 ）n样品：蓝葡聚糖样品：蓝葡聚糖-2000、重铬酸钾混合液、重铬酸钾混合液（各（各1mg/ml）n洗脱液：纯水洗脱液：纯水三器材和试剂三器材和试剂 1. 1.装柱装柱 n装柱是装柱是最关

17、键最关键的一步。的一步。n重力沉降法装柱重力沉降法装柱n陆续不断陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。的柱床体积为止。 n柱的表面始终要保持着一层溶剂柱的表面始终要保持着一层溶剂( (一般一般l l3cm3cm柱高柱高) )柱的柱的任何一部分绝对不能任何一部分绝对不能“流干流干”。 四四. . 操作方法操作方法n层析柱的形状，一般直径层析柱的形状，一般直径 与高度的比为与高度的比为l l：1515为宜。为宜。n柱形必须根据层析介质和柱形必须根据层析介

18、质和 分离目的而定分离目的而定。待分离物待分离物 质的性质相近，柱越质的性质相近，柱越细长细长， 则分离效果越好，但流速则分离效果越好，但流速 较慢。在样品组分并不复较慢。在样品组分并不复 杂的情况下，采用杂的情况下，采用“矮胖矮胖柱柱”. .要求要求: :垂直垂直 柱面平柱面平 无气泡无气泡 无节痕无节痕 松散松散 均匀均匀 n灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，床高度，不能时断时续不能时断时续，否则将出现分层或，否则将出现分层或“纹路纹路”等毛病。若在灌好胶后才发现等毛病。若在灌好胶后才发现“纹纹路路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响

19、、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果层析效果。n层析柱正式使用前，必须平衡至所需的层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pHpH和离子强和离子强度，一般使用前用相当于柱床体积度，一般使用前用相当于柱床体积2-32-3倍的洗脱液倍的洗脱液流过凝胶柱，以流过凝胶柱，以压实凝胶，稳定柱床压实凝胶，稳定柱床，称为平衡。，称为平衡。 n检查柱是否均匀，可用蓝色葡聚糖检查柱是否均匀，可用蓝色葡聚糖20002000，在恒压下，在恒压下走柱，如色带均匀下降，说明柱是均匀的，可以使走柱，如色带均匀下降，说明柱是均匀的，可以使用，否则应重新装柱用，否则应重新装柱. .n在平衡期间可调流速在平衡期间可调流速.

20、. 2.2.平衡平衡3.3.加样加样 要求要求: :样品体积和浓度不变样品体积和浓度不变(1.0ml)(1.0ml)有有3 3种方法可将样品加到已制备好的柱顶：种方法可将样品加到已制备好的柱顶：n1.1.简单的方法是放除柱床表面以上的溶液，简单的方法是放除柱床表面以上的溶液，但切忌液面低于凝胶表面但切忌液面低于凝胶表面。然。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口开关，后将样品加在凝胶表面，打开柱下口开关， 使样品慢慢渗入凝胶内。加使样品慢慢渗入凝胶内。加样时样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下，也不能沿管壁流下， 当慢慢渗入当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝胶

21、柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶凝胶的样品液液面与凝胶柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（柱面上加一层（1 12cm2cm柱高）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱柱高）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。n2.2.不需要让柱流干至床表面，而是加入不需要让柱流干至床表面，而是加入1 1浓度浓度的蔗糖来增加样品的密度；的蔗糖来增加样品的密度；n3.3.方法是用一个毛细管和一个注射器或蠕动泵方法是用一个毛细管和一个注射器或蠕动泵把样品直接传送到柱表面把样品直接传送到柱表面( (如一些商品柱附有专如一些商品柱附有专门加样装置门加样装置) )。n保持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干保持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干裂十分重要。为此，除加样时注意不破坏胶面平裂十分重要。为此，除加样时注意不破坏胶面平整外