第七章-基因工程菌的发酵ppt课件(全)

1、第七章 基因工程菌的发酵 第一节 基因工程发酵概述第二节 基因工程生化产品的分离纯化【学习目标】知识目标：能够陈述基因工程菌的培养方式及发酵设备 ；能够掌握基因工程菌发酵产品的分离纯化原理及方法 ；能够掌握基因工程菌生产菌种的保存及管理方法；能力目标：掌握基因工程菌发酵生产流程 ；掌握基因工程菌发酵过程中表达系统、培养基、温度、pH值、溶解氧和诱导条件等因素对发酵的影响 。3第一节 基因工程发酵概述一、基因工程菌的培养方式二、基因工程菌的发酵设备三、基因工程菌的发酵工艺4基因工程（Genetic Engineering）：又称基因拼接技术和DNA重组技术。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操

2、作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。5基因工程基本过程6一、基因工程菌的培养方式1.分批培养2.补料分批培养3.连续培养4.透析培养5.固定化培养1.分批培养分批培养：将定量的微生物接种到封闭的具有定量培养基的容器中，保

3、持一定的温度、pH、DO，微生物进行生长繁殖。分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限。2.补料分批培养补料分批培养：在分批发酵过程中补充培养基，而不从发酵体系中排出发酵液，使发酵液的体积随着发酵时间逐步增加。特点：能够调节培养环境中营养物质的浓度：一方面，它可以避免在某种营养成分的初始浓度过 高时影响细胞的生长代谢以及产物的形成；另一方面，它还能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。3.连续培养连续培养：是采用有效的措施让微生物在某特定的环境中保持旺盛生长状态的培养方法。不断地流加营养，并不断地取出发酵液。其中的微生物可长期保持在对数期的平衡生

4、长状态和稳定的生长速率。连续培养可提高发酵工业的生产效益和自动化水平，此法已成为目前发酵工业的发展方向。连续培养如用于发酵工业中就称为连续发酵(continuous fermentation）。连续发酵与分批发酵相比有许多优点： 自控性，便于利用各种仪表进行自动控制； 高效，它使装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等工艺简化了，缩短了生产时间和提高了设备的利用效率； 产品质量较稳定； 节约了大量动力、人力、水和蒸汽，使水、汽、电的负荷减少。但也存在不足之处： 主要是菌种易于退化，使微生物长期处于高速繁殖的条件下，即使自发突变率很低，也难以避免变异的发生； 容易污染，在连续发酵中，要保持各种设备无渗漏，

5、通气系统不出现任何故障，是极其困难的。因此，“连续”是有时间限制的，一般可达数月至一年、两年； 连续培养中，营养物的利用率低于分批培养。4.透析培养透析培养：是对微生物培养用透析膜包裹，并使外部有新鲜培养液流动着的一种培养方法。特点：微生物可不断地受到新营养的补给，同时也不断地排出老朽废物，因此可以延长对数期的增殖，增大静止期的细胞数。通过外液的培养液成分的变化，可使微生物的营养环境慢慢发生改变，同时也可隔着膜培养两种微生物，通过其产生物来了解它们的相互关系。5.固定化培养固定化培养：是通过化学或物理方法，将游离细胞或酶固定于限定的空间区域内，使其保持活性并可以反复利用。优点：菌体密度高、反应

6、速度快、发酵周期短、产物分离简单、反应过程控制容易、菌体可重复连续使用和增加发酵过程中重组质粒稳定性的优点。固定化：英文名immobilized; immobilization; 所谓固定化是指用物理或化学方法使酶成为不溶性衍生物或使细胞成为不易从载体上流失的形式制成生物反应器用以催化生化反应、细胞数量的增殖等。二、基因工程菌的发酵设备1.发酵罐结构2.发酵罐中的反应和参数3.发酵罐控制系统1.发酵罐结构发酵罐组成：发酵罐体 搅拌器（高传质作用） 温控系统 灭菌系统 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量和控制系统（pH值、O2等） 培养液配制 连续操作装置要求：发酵罐提供菌体生长的最适

7、条件； 培养过程不得污染，保证纯菌培养； 培养及消毒过程中不得游离出异物，干扰细胞代谢活动。2.发酵罐中的反应和参数反应：涉及细菌遗传特性有关的分子水平的反应； 与细菌代谢调节有关的细胞水平的反应； 和热量、质量、动量传递特性有关的工程水平的反应。参数： 常测定：温度、搅拌速度、pH值、DO值、糖含量、罐压、效价 NH3-N含量、前体浓度、菌体浓度等。 不常测定：氧化还原电位、黏度、排气中氧气和二氧化碳含量等3.发酵罐控制系统发酵罐控制系统：传感器、计算机、执行器件传感器： 在线测量的传感器：测量pH值的发酵耐高温电极、测量发酵罐DO值的电极、氧气分析仪、二氧化碳分析仪等。 需二次传感技术的传

8、感器：酶电极、微生物电极、免疫敏感电极、电化学电极、光学生物传感器及热敏、离子敏场效应管等（测量时，需将发酵液引出罐外测定，可采用罐外流通式测量和流动注射法（FIA）测量等技术）。三、基因工程菌的发酵工艺1.基因工程菌发酵培养基组成2.基因工程菌的发酵条件控制基因工程菌的基本流程 基因工程菌摇瓶培养初步确定工程菌的生长条件发酵罐放大培养确定最佳工艺参数 用于制药的基因工程菌属于化能异养、好氧型微生物，在有氧的条件下，氧化培养基中的碳源、有机或无机氮源提供能量（APP），进行发酵生长和繁殖。1.基因工程菌发酵培养基组成（1）碳源：是基因工程菌生长的第一营养物质，其作用在于为正常生理活动和过程提供

9、能量来源，也为细胞物质和代谢产物的合成提供骨架。基因工程菌发酵的物质：碳源、氮源、无机盐、生长因子和选择剂等。可利用的碳源：糖类、有机酸、脂类和蛋白质类。 常用的碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。大肠杆菌利用的碳源：蛋白胨、酵母粉等；酵母菌能利用的碳源：葡萄糖、半乳糖等单糖物质；丝状菌利用的碳源：单糖、淀粉等。（2）氮源常用的氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水等。 氮源为基因工程菌生长提供氮素的来源，用于合成氨基酸、蛋白质、核苷、核酸及其他含氮物质。 缺乏氮源细胞无法生长。 酪蛋白水解物有利于产物的合成和分泌。培养基中的色氨酸对trp启动子控制的基因表达有影响。（3）

10、无机盐 无机盐：磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素；铁、铜、锌、锰等微量元素，为基因工程菌生长提供必需的矿物质，对代谢具有重要的调节作用。无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，在生物大分子的合成、糖代谢、细胞呼吸及ATP 浓度的控制中，过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体生产和氧消耗过程。 启动子只有在低磷酸盐时才被启动，因此，必须控制磷酸盐浓度，使细菌生长到一定浓度，磷酸盐被消耗至低浓度时，目的蛋白才被表达。 起始磷酸盐浓度应控制在0.015mol/L左右，浓度低影响细菌生产，浓度高则导致外源基因不表达。4.生长因子生长因子是指细胞生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮源作用。生长因子

11、：维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪等，在胞内起辅酶和辅基等作用，参与电子、基团等的转移。由于蛋白胨等天然成分含有各种生长因子，因此，一般在基因工程菌培养基中不单独添加。（5）选择剂、诱导物基因工程菌具有营养缺陷或携带选择性标记基因，这种特性保证了基因工程菌的纯正性质粒的稳定性。选择性标记有两类：营养缺陷互补标记和抗生素抗性选择标记。基因工程大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉素、真菌等含抗生素抗性基因，常用卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等作为选择剂。基因工程酵母菌常用氨基酸营养缺陷型，如亮氨酸、赖氨酸、色氨酸等。对于诱导表达型的基因工程菌，在细胞生长到一定阶段，必须添加诱导物，以解除目标

12、基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。第二节 基因工程生化产品的分离纯化一、细胞破碎二、去除杂质三、产物的分离纯化四、分离纯化方法的选择建立分离纯化的依据1.含目的产物的起始物料的特点2.物料中杂质的种类和性质3.目的产物的特性4.产品的质量要求基因工程菌生化产品的分离与传统发酵产物的分离纯化相比，具有以下特点：1.产物大多在细胞内，提取前要破碎细胞；2.产物浓度低，杂质多，提纯难度大；3.产物是大分子蛋白质，易失活。一、细胞破碎 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 结合重

13、组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。细胞破碎方法（按是否使用外加作用力）二、去除杂质 在纯化过程中，非蛋白质类杂质不应忽视，需要特别注意3种可能存在的非蛋白质类杂质，它们是DNA、热原质和病毒。1.去除DNA DNA在pH值为4.0以上呈阴离子形式，可用阴离子交换剂吸附除去，但目的蛋白pI值应在6.0以上。 如果蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而不让DNA吸附上去。 利用亲和色谱吸附蛋白质，而DNA不被吸附，也可分离。2.去除热原质 热原质（pyrogen）即菌体中细胞壁的脂多糖，大多是革兰氏阴性菌产生的。注入人或动物体内能引

14、起发热反应，故名热原质。 相对分子质量小的多肽或蛋白质中的热原质可用超滤或反渗透的方法去除，但对大分子蛋白质无效。 脂多糖是阴离子物质，可用阴离子交换色谱去除。 脂多糖中脂质是疏水性的，可用疏水色谱法去除。 用亲和色谱法去除，配基有多粘菌素B、变形细胞溶解物或广谱的抗体。 3.去除病毒 成品中必须检查是否含病毒，因为病人的免疫能力低，易受病毒感染。 病毒的最大来源是由宿主细胞带入。 色谱分离一般能将病毒去除。 必要时，可用紫外线照射使病毒失活，或用过滤法将病毒去除。 三、产物的分离纯化 工程菌或工程细胞经过细胞破碎和固液分离后，目的产物仍与大量杂质混合在一起，这类杂质可能有病毒、热原质、氧化产物、核酸、多聚体、杂蛋白、与目的物类似的异构体等。 分离纯化主要依赖色谱分离方法。该法优点：多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。色谱技术主要有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱等。 基因工程产品制备过程中常用的分离纯化方法四、分离纯化方法的选择分离纯化应遵循的基本原则：1.具有良好的稳定性和重复性；2.尽可能减少组成工艺的步骤；3.各技术和步骤之间能相互适应和协调，工艺与设备能相互适应；4.