遗传修饰动物模型在生物技术药物安全性评价

1、遗传修饰动物模型在药物安全性评价中的应用1转基因动物的定义相对于野生型动物而言，其基因组被遗传修饰的动物有用遗传修饰动物 (Genetic altered animal)一词2转基因动物分类用于基础生物学研究 - 基因的结构和功能的关系 - 细胞核与细胞质的相互作用 - 胚胎发育和调控等生命科学中的基本问题用于育种改良 -提高动物的生长速度 -改善肉质营养 -增强抵抗疾病的能力用于生产目的蛋白、生物反应器 - tPA，凝血因子用于各种疾病动物模型 -癌症转基因动物模型 -免疫缺陷动物模型等3转基因动物模型安全性评价优势对受试物的敏感性增加。 -如带有激活Pim-l肿瘤基因的转基因动物，对乙基硝

2、基脲的致癌作用，较相应的非转基因动物，其敏感性提高了25倍。转基因动物模型用于安全评价，节省时间，缩短实验进程，减少动物的用量，符合3R原则 -传统的致癌性实验采用普通大小鼠，实验长达2年，时间长，需要的动物数量大，采用转基因动物模型，可以在6个月内得知结果，显著节省时间 -采用TgPVR21转基因小鼠替代猴进行神经毒性测试，测试效果与猴一致4国际获得广泛认可的癌症动物模型TG:ACrasH2p53+/-XPA-/-TG:AC，p53+/-和rasH2模型在美国或日本已实现商品化，并获得ICH等国际机构的认可5TG:AC小鼠模型的建立和生物学特性人类正常的ras基因家族包括c-Ha-ras，c

3、-Ki-ras和c-N-ras三个成员，其中c-Ha-ras位于11号染色体上ras基因编码细胞增殖信号传导途径中的一个189个氨基酸的关键蛋白分子P21蛋白，是生长因子受体与下游分子联系的必经之路，其活性可以通过与GTPGDP的交换来调节P21蛋白在细胞分化和抑制细胞凋亡中扮演很重要的作用ras基因在第12、13、59、61位氨基酸发生突变时，其编码的蛋白活性增高，易诱导癌变6TG:AC小鼠模型的建立和生物学特性该模型是通过显微注射的方法获得的受精卵来自近交系FVB小鼠转基因表达的部位包括胚胎期的血液、肝和胎盘。此外在成年小鼠的骨髓中也有低水平的表达用佛波酯 (Phorbol ester)处

4、理转基因鼠，6个星期内能诱导产生多种乳头瘤，部分小鼠发生鳞状细胞瘤，多数情况下产生恶性肉瘤7RasH2转基因鼠模型的建立及生物学特性（一）转入该模型的DNA为人的正常ras基因 (c-Ha-ras)，全长大小为6.8 Kb转化型ras基因最初是从日本病人恶性黑色素瘤组织中获得的，被保留在裸鼠NIH 3T3成纤维细胞中扩增8RasH2转基因鼠模型的建立及生物学特性（二）该模型十分稳定，从未出现过应答消失特别适合对食道癌研究rasH2转基因模型诱发肿瘤的器官主要限于肺、皮肤和前胃2000年又建立了c-Ha-ras转基因大鼠模型，命名为Hras128。该大鼠转基因模型不仅可用于筛选致癌物和癌症诱导因

5、子，还可用于筛选抑制癌症的药物9c-Ha-ras转基因小鼠的检测标记基因斑点杂交和PCR扩增Southern杂交Northern杂交表达产物检测10p53+/-小鼠模型的建立及生物学特性p53蛋白首先发现于SV40病毒转化的啮齿类动物细胞C57BL/6转基因小鼠模型在6个月时易自发产生多种肿瘤，但胚胎发育正常这一模型从整体动物水平证实了p53基因与胚胎发育无直接相关性，但它的缺失使动物易发生肿瘤类疾病11XPA-/-小鼠模型的建立及生物学特性着色性干皮病 (Xeroderma pigmentosum, XP)是一种常染色体隐性遗传病，受到日照后易发生皮肤癌和神经综合症该模型是在NER基因成功克

6、隆的基础上，以干细胞为基础，通过基因敲出的方式构建的该模型不仅仅对紫外线敏感，而且对一些致癌性化学物也非常敏感，能诱导产生多种内脏肿瘤12转基因动物用于评价需要注意的问题必须有完全的病理学检查需要非转基因小鼠或者野生型小鼠作为对照需要检测转入基因是否稳定等实验周期可能超过6个月，也需要更多的实验动物13国际上转基因动物应用的指导原则1995年FDA “生产和检验源于转基因动物的人用生物制品的指导原则”(Points to Consider in the Manufacture and Testing of Therapeutic Products for Human Use Derived f

7、rom Transgenic Animals)。该指导原则规定了首建动物的创建和繁殖、转基因动物及其后代的饲养与维护等基本准则欧盟EMEA (European Medicine Evaluation Agency)通过其下属机构CPMP (Committee for Proprietary Medical Products)制定了内容相似的指导原则。ICH在着手修订相应的指导原则，以促进转基因动物模型在致癌性实验中的应用14FDA制定的指导原则转基因动物的定义转基因动物的饲养转基因动物的维持转基因动物的使用使用后的转基因动物的处置15转基因动物的定义通过导入重组DNA的方法制作的人为修饰动物，

8、包括两类：一种为可遗传的修饰，一种为体细胞非遗传修饰第一类转基因动物包括通过对配子、早期胚胎或者胚性干细胞系的体外操作获得可通过生殖细胞遗传的动物第二类包括通过质粒注射、病毒介导的基因转移等基因治疗手段获得的体细胞改变的动物转基因 (Transgene) 指的是一段导入体细胞的或者稳定整合在宿主基因组中并能稳定遗传给下一代的重组DNA16首建转基因动物的建立及性质分析配子或者胚性细胞供体动物及代孕动物的来源及历史必须明确转基因的方法需清楚必须写明首建转基因动物的鉴定方法，建立转基因鉴定的灵敏度检测标准，区分转入外源基因但不表达目标产物的动物与未进行转基因操作的动物当将转基因动物作为食品供人食用

9、时，必须符合FDA (CVM或CFSAN)或者FSIS的管理规定一旦建立了首建转基因动物，转基因的稳定性必须持续监测17建立持续可靠的转基因动物源 (首建转基因动物系)转基因动物应建立主转基因动物库 (Master transgenic bank, MTB)工作转基因动物库 (Manufactures working transgenic bank，MWTB)18转基因动物的生产与选择应该建立标准 -历史来源，每一只转基因动物能溯源到它的首建转基因动物 -产地、出生日期、用途、疾病发生时间及处置方法详细记录转基因动物的育种方法 -任何人工受精、胚胎移植、精子采集与存储方法以及所采用的标准建立生产转基因动物的质量标准19转基因动物的维持疾病监控圈养设施生产群中转基因动物的淘汰与处置哨兵动物的设置20转基