第六章核糖体和核酶

1、1. 发现核糖体及核糖体功能鉴定的两个关键技术是什么 ?答：核糖体最早是Albert Claude于1930s后期用暗视野显微镜观察细胞的匀浆物 时发现的，当时称为微体(Microsomes),直到1950s中期，George Palade在电子 显微镜下观察到这种颗粒的存在。当时George Palade和他的同事研究了多种生物的细胞, 发现细胞质中有类似的颗粒存在, 尤其在进行蛋白质合成的细胞中特 别多。 后来 Philip Siekevitz 用亚细胞组份分离技术分离了这种颗粒, 并发现这些 颗粒总是伴随内质网微粒体一起沉积。 化学分析揭示, 这种微粒富含核苷酸, 随 之命名为ribos

2、ome,主要成分是核糖体 RNA(rRNA)，约占60%、蛋白质(r蛋白 质)约占 40%。核糖体的蛋白质合成功能是通过放射性标记实验发现的。将细胞 与放射性标记的氨基酸短暂接触后进行匀浆， 然后分级分离， 发现在微粒体部分 有大量新合成的放射性标记的蛋白质。 后将微粒体部分进一步分离， 得到核糖体 和膜微粒， 这一实验结果表明核糖体与蛋白质合成有关。 两个关键技术是亚细胞 组份分离技术和放射性标记技术。2说明人体单倍体染色体组中四种 rRNA基因的组成、排列方式和拷贝数。答：在人基因组的四种rRNA基因中，18S、5.8S和28S rRNA基因是串联在一 起的，每个基因被间隔区隔开，5S的r

3、RNA基因则是编码在另一条染色体上。前3个基因组成一组， 分布在人的 13、 14、 15、 21、 22 等5条染色体上。在 间期核中，所有这5条染色体rRNA基因区域，转录时聚集在一起， 形成一个 核仁。在人体单倍体染色体组中，每组rRNA基因有200个拷贝。每一拷贝为一个 rDNA 转录单位。这 3 个基因是纵向串联排列在核仁组织者的 DNA 上。真 核细胞核糖体的5S rRNA基因则是独立存在于一个或几个染色体上，拷贝数达几千个。在人的细胞中， 该基因的拷贝有 24000 个之多， 它们串联排列在 1 号染色体接近末端处。3根据 3H 标记的尿嘧啶和放线菌素 D 研究人的培养细胞前体

4、rRNA 的合成， 推测出前体rRNA的加工过程， 请问3H标记的尿嘧啶和放线菌素 D各起什么 作用 ?答： 3H 标记的尿嘧啶是追踪 RNA 的， 而加入放线菌素 D 是为了阻断 RNA 的合 成，这样随着RNA加工的进程，rRNA分子越来越小， 便于判断。如果不阻 断 RNA 合成， 新合成的 45SrRNA 就会干扰判断。在上述的研究中发现， 当 人的细胞同3H标记的尿嘧啶共培养25分钟后，被标记rRNA的沉降系数是45S， 加入放线菌素D阻断RNA的合成后，标记的45S rRNA首先转变成32S的rRNA， 随着培养时间的延长，逐渐出现被标记的 28S、18S的rRNA。有人用核糖体重

5、组实验得到一些重要的结论，你能说出一、二吗 ?答：这些结果包括以下几个方面：30S亚基的蛋白质专同16S rRNA结合；50S亚基的蛋白质只同23S rRNA结合，如果把30S亚基rRNA和50S亚基的蛋白质 相混合，则不能装配成有功能的亚基。从不同种细菌提取30S亚基的rRNA和蛋白质，可装配成有功能的30S亚基，这表明不存在种间差异。原核生 物核糖体与真核生物核糖体的亚基彼此不同， 由二者的 rRNA 和蛋白质重组后 的核糖体没有功能。 大肠杆菌的核糖体与玉米叶绿体核糖体亚基重组后具有功 能。由于不同生物的线粒体核糖体大小不同，由55S到80S不等，而原核生物的核糖体基本稳定， 所以线粒体

6、的核糖体亚基同原核生物核糖体亚基相互交换 形成的杂合核糖体没有功能。真核细胞中核糖体的合成和装配过程如何 ?答： 整个过程相当复杂， 首先要合成与核糖体装配有关的蛋白质，这些蛋白质包括核糖体结构蛋白和与前体 rRNA 加工有关的酶。 它们都是在细胞质的游离核 糖体上合成， 然后迅速集中到细胞核并在核仁区参与核糖体亚基的装配。 而组成 核糖体亚基的 18S rRNA、5.8 SrRNA 和 28S rRNA 基因则是在核仁中边转录边参 与核糖体亚基的装配， 5S rRNA 却是在细胞核中转录后运送到核仁中参与核糖 体亚基的装配。装配过程中，45S RNA、5S RNA同蛋白质形成80S RNA颗

7、粒， 然后80S颗粒被降解成大小两个颗粒，大颗粒为55S,含有32S和5S两种RNA , 小颗粒含有20S的前体rRNA。然后，小颗粒中的20S RNA前体被快速降解成18S 的rRNA，并运送到细胞质中，即是成熟的核糖体小亚基。55S大颗粒中的32SRNA 被加工形成 28S 和 5.8S 两种 rRNA 成为成熟的大亚基后，被运送到细胞 质中，这个过程比较慢。如果这时有 mRNA 同小亚基结合的话，大亚基即可结 合上去形成完整的核糖体，并进行蛋白质的合成。二十世纪六十年代初期 Robert Perry 发现核糖体的合成是在核仁中进行的， 请问他是如何发现的 ?答: 二十世纪六十年代初期 R

8、obert Perry 用紫外微光束破坏活细胞的核仁，发现 破坏了核仁的细胞丧失合成 rRNA 的能力，这一发现提示核仁与核糖体的形成有 关。后来Perry又发现低浓度的放线菌素 D能够抑制3H-尿嘧啶掺入rRNA中， 而不影响其他种类的 RNA 合成。显微放射自显影也显示放线菌素 D 能够选择性 阻止核仁 RNA 的合成，表明核仁与 rRNA 的合成有关。原核生物蛋白质合成起始复合物形成包括哪些过程 ?需要哪些因子参与 ?答：主要分为三步， 参与的因子包括起始因子1-3，以及mRNA、转运tRNA、 GTP等。30S亚基与mRNA的结合mRNA不能与完整的核糖体结合，但是能 够同独立存在的3

9、0S核糖体小亚基结合。在原核生物中，30S核糖体小亚基通过16S rRNA与mRNA起始密码子AUG上游的SD序列的互补，从而与mRNA结 合。核糖体小亚基与 mRNA的结合还需要起始因子（initiation factor. IF）的帮助， 原核生物的起始因子命名为IFs，真核生物的起始因子命名为 elF&原核生物有 三种起始因子，其中有两种（IF1、IF3）通过与30S核糖体亚基的结合帮助30S亚 基与mRNA的识别与结合。 第一个aa-tRNA进入核糖体 当mRNA与核糖体 小亚基结合后， 携带甲酰甲硫氨酸的 tRNA 通过反密码子与 mRNA 中 AUG 的识 别从而进入核糖体。起始

10、tRNA 在与 mRNA 形成 mRNA-30S 亚基复合物之前， 必须同GTP、起始因子IF2结合，形成 GTP-IF2-tRNAfMet复合物。起始tRNA 复合物与mRNA的AUG密码子结合后，释放IF3。 完整起始复合物的装配 一 旦起始 tRNA 与 AUG 密码子结合，核糖体大亚基就加入到复合物中形成完整的 核糖体 -mRNA 起始复合物。该过程伴随 GTP 的水解、 IF1 和 IF2 的释放。其中 GTP 的水解可能引起核糖体构型的变化，而改变了的构型正是蛋白质合成所必 需的。请详细说明多肽链延伸的过程。答：蛋白质合成的肽链延伸涉及四个重复的步骤：氨酰tRNA进入核糖体的A位点

11、；肽键形成；转位：脱氨酰tRNA释放。上述四步的循环，使肽链不 断延长。在整个过程中，需要 GTP和一些延长因子的参与。氨酰-tRNA进入 A 位由于起始 tRNA 占据 P 位点，核糖体开始接受第二个氨酰 -tRNA 进入 A 位 点，此即为延伸的第一步。第二个氨酰 -tRNA 在进入 A 位点之前，必须与结合 有GTP的蛋白延伸因子结合（原核细胞中延伸因子是Tu，真核生物则是eEF1）。 Tu起传递作用，即将氨酰-tRNA传递给核糖体。虽然任何氨酰-tRNA-Tu-GTP都 有可能进入 A 位，但只有反密码子与 A 位点密码子相匹配的 tRNA 才允许进入A位。一旦合适的氨酰-tRNA-T

12、u-GTP同A位点的密码子结合，GTP水解，Tu-GDP 被释放。肽键形成当核糖体的 P位和A位都有tRNA占据时，进入核糖体的 两个氨基酸是分开的， 所以延伸反应的第二步是两个氨基酸相互作用， 通过肽键 的形成将两个氨基酸结合起来。即由 A 位的 aa-tRNA 上氨基酸的氨基与 P 位 aa-tRNA上氨基酸的羧基间形成肽键，使P位的tRNA卸去氨基酸，而A位上的tRNA形成了二肽。肽键的形成是自动发生的，不需要额外的能量。这一反应 是由肽酰转移酶（peptidyl transferase催化的，该酶是核糖体大亚基的组成成份。 多年来一直认为肽酰转移酶是组成 50S亚基的一种蛋白，现在已经

13、清楚，它是构 成核糖体的RNA，是核酶。转位（translocation）当形成了第一个肽键时，A位 点上的 tRNA 分子的一端仍然与 mRNA 的密码子结合，而另一端与肽结合 .此时 P 位点上的 tRNA 没有氨基酸的结合。 接下来进入延伸反应的第三步 :转位，即核 糖体沿着mRNA从5, 7 方向移动三个核苷酸（一个密码子），在此过程中，A 位的tRNA-二肽移到P位，而P位的tRNA则进入E位点。转位需要另一个GTP 结合的延伸因子的参与（原核生物是延伸因子 G,真核生物是延伸因子 eEF2）。 GTP水解释放的能量转变成机械能， 将核糖体沿着mRNA移动大约1 nm。脱 氨酰 tR

14、NA 的释放 延伸反应的最后一步是脱氨酰 tRNA 离开核糖体的 E 位点。 一旦肽酰tRNA转位到P位，A位点再次开放，接受下一个aa-tRNA。在这种情 况下，进入的氨酰 -tRNA 的反密码子必须与第三个密码子互补， 开始下一个循环。 在蛋白质合成的延伸反应中，每一次循环至少水解两分子的 GTP， 耗时二十分 之一秒，速度之快是惊人的。在肽链延伸过程中 tRNA 的转位是是如何进行的 ?答: 通过足迹法 （footprinting） 分析， 揭示在蛋白质合成的延伸循环中， tRNA 的转 位是分两步进行的，并且相互独立（图Q6-1）。肽键的形成引起新形成的肽酰 tRNA大亚基的受体部分从

15、 A位向P位偏移，而它的小亚基的反密码子部分仍然 与 A 位的密码子相连 （此时的状态称为 A/P 结合状态 ）。新形成脱氨酰 tRNA 的受 体从大亚基的 P 位向 E 位偏移，而它的反密码子部分仍然在小亚基的 P 位，此 时的状态称为P/E结合状态。核糖体与 EF-G-tRNA 复合物结合，引起这些 tRNA 的反密码子的末端与它们 结合的 mRNA 一起相对于小亚基移动，使得肽酰 -tRNA 完全占据大、小亚基的 P位点（P/P结合状态），而脱氨酰tRNA则完全移到大亚基的E位点。多聚核糖体形成的意义何在 ? 答: 同一条 mRNA 被多个核糖体同时翻译成蛋白质，大大提高了蛋白质合成的速

16、率，更重要的是减轻了细胞核的负荷，减少了基因的拷贝数， 也也减轻了细胞核进行基因转录和加工的压力。如何根据嘌呤霉素实验的结果判断核糖体中的 A、P是两个分开的独立位点？ 答：可以这样分析：在第一组实验中，只有起始tRNA占据P位，如果A位点是 一个独立位点的话，此时的 A 位点就是空闲的，嘌呤霉素当然能够结合上去， 如果 A 位点与 P 位点是同一位点，那么嘌呤霉素就不能与核糖体结合，实验结 果是嘌呤霉素能够结合。在第二组实验中，由于 A 位点已经被二肽酰 tRNA 占 据，所以嘌呤霉素无法与 A位点结合，只有加入延伸因子和 GTP后，使A位点 腾空，嘌呤霉素才能结合到核糖体上。因此两根据这两

17、组实验结果可以断定 A、 P 是两个独立的功能位点。根据原核细胞中反义 RNA 作用方式的不同分为三类，请推测它们的作用方 式有什么不同 ?答:这三类反义RNA的作用特点分别是：I类反义RNA直接作用于其靶mRNA的 SD 序列和 /或编码区，引起翻译的直接抑制 （1A 类 ）; 或与靶 mRNA 结合后引 起该双链RNA分子对RNA酶川的敏感性增加，使其降解（1B类）U类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶 mRNA的翻译功 能，其作用机理尚不清楚，可能是反义 RNA 与靶 mRNA 上游序列结合后， 会 引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变， 从而抑制了与核糖体

18、的结合。川类反义 RNA可直接抑制靶 mRNA的转录：如tic RNA（transcriptioninhibitory complementary RNA）是大肠杆菌中CAP蛋白（cAMP结合蛋白）的mRNA的反义 RNA。 ticRNA 基因的启动子可被 cAMP-CAP 复合物所激活，从 CAP mRNA 的 转录起始位点上游 3 个核苷酸处开始， 以 CAP mRNA 的模板 DNA 链的互补链 为模板， 合成 ticRNA。 ticRNA 的具体长度不清楚， 但是它的 5端一段正好 和 CAP mRNA 的 5端有不完全互补，可以形成 RNA 双链杂合体。而在 CAP mRNA上紧随杂

19、交区之后的是一段约长 11bp的A?U丰富区。这样的结构与 p 因子不依赖性的转录终止子的结构十分相似，可以使CAP mRNA的转录刚刚开始不久即迅速终止。这一例子是 CAP 蛋白合成的自我调节的最好说明。当 CAP 合成达到一定量之后， 即与 cAMP 结合形成 cAMP-CAP 复合物，再激活 ticRNA 的启动子转录出 ticRNA， 反过来抑制 CAP-mRNA 的合成。核酶是如何被发现及证实的 ? 这一发现有什么意义 ?答：1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的 26S rRNA前体加工去除 基因内含子时获得一个惊奇的发现：内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和 纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是：内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。为了证明这一发现， 他们将编码 26S rRNA 前体 DNA 克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成 26S rRNA 前体分子。结果发现这种人工制备的 26S rRNA 前体分子在没有任何蛋白 质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。这种现象称为自我