内质网相关的凋亡途径在高三尖杉酯碱诱导MUTZ1细胞凋亡过程中的

1、内质网相干的凋亡途径在高三尖杉酯碱诱导MUTZ-1细胞凋亡历程中的胡洁何冬花高良杨春虎蔡真【摘要】本研究探究高三尖杉酯碱(Hharringtnine,HHT)诱导人DS细胞株UTZ-1细胞凋亡的作用机制。以HHT处置惩罚骨髓增生非常综合征细胞株UTZ-1DS-RAEB,用流式细胞术检测细胞凋亡率，用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位变革，应用RT-PR检测HHT处置惩罚前后与内质网应激有关的基因HP,BIP,XBP1的表达环境。效果表白：0.05g/lHHT作用UTZ-1细胞的凋亡率随着时间的延伸而增长，其差异具有统计学意义P0.01；激光共聚焦效果表现，0.05g/lHHT作

2、用后4小时胞浆内a2+浓度增高，12小时达岑岭，厥后开始落落；HHT作用后线粒体膜电位连续落落；HP以及BIP,XBP1基因表达加强，12小时到达岑岭，厥后开始落落。结论:HHT可以诱导DS细胞株UTZ-1凋亡，内质网相干的凋亡途径在此中发挥了紧张的作用。【关键词】高三尖杉酯碱；DS细胞株UTZ-1；细胞凋亡；内质网应激RlefEndplasiRetiuluPathayinApptsisfDSellsInduedbyHharringtnineKeyrdshharringtnine;UTZ-1ell;apptsis;ERstress骨髓增生非常综合征DS是一组异质性的造血干细胞疾病，病理生理学改

3、变为造血前体细胞成熟停滞和过分增殖，易于向白血病转化1,2,其发病和治疗机制是如今临床研究的热门。高三尖杉酯碱(HHT)是我国自主研制乐成的高效抗白血病药物3，临床上用来治疗DS获得必然的疗效，本研究组前期事情表白HHT重要通过诱导细胞凋亡发挥抗白血病作用4,我们进一步研究表白，在此历程中内质网发挥了紧张的作用。质料和要领重要试剂HHT(1g/l)购自杭州民生药厂，在利用之前用RPI1640RPI1640干粉购自Gib公司稀释至所需浓度。Flu3/A购自美国Bitu公司，J-1购自Siga公司，Annexin-V/PI,it-traker,ER-traker购自leularprbe公司，鼠抗人

4、荧光二抗购自ellsignal公司。细胞造就人DS细胞系UTZ-1引自德国BraushEig细胞中央5;在5%2、37条件下,于含10%胎牛血清、100U/l青霉素、100g/l链霉素的RPI1640造就液中造就传代,实行用细胞均处于对数生恒久。细胞凋亡的测定接纳流式细胞术举行AnnexinV/PI双标识表记标帜测定。取经HHT处置惩罚后的各组细胞，调解浓度为2.0105/l，参加AnnexinV/FIT5l和PI0.5l，室温避光30分钟，用PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测。细胞内钙浓度变革的共聚焦激光扫描显微镜检测6网络处置惩罚后的各组细胞，用奇怪造就液调解细胞密度为2106/l，参加fl

5、u3/A终浓度为5l/L,37下避光温育35分钟，Hanks液洗涤2次。用Laia-TSSP激光共聚焦扫描显微镜对细胞内钙举行检测，引发波长为488n,发射光为527n。线粒体膜电势变革的共聚焦激光扫描显微镜检测7J-1为一种特异性的阳离子荧光染料,可定位在线粒体膜上,其引发光为490n,单体发射光为527n,多聚体发射光为590n,其聚拢程度与膜电位成正比。当线粒体膜电位增高时,赤色荧光加强,赤色荧光和绿色荧光的比值可代表膜电位的凹凸。网络差异处置惩罚组的细胞,用奇怪造就液调解细胞密度为2106/l，然后与10g/lJ-137负载30分钟,PBS洗2次后用共聚焦显微镜检测。以赤色荧光值与绿色

6、荧光值的比值的巨细来表现膜电位的凹凸。凋亡前因子HP基因、内质网未折叠卵白质基因BIP,XBP1RNA表达程度的RT-PR检测引物：HP357bp上游5-AGTATTGTTT-TTTG-3，卑劣5-GGTGAGATTAATTGG-3；BIP(231bp)上游5-ATAGGTTATGTG-3；卑劣5-TTTTTTAT-3；XBP1(441bp)上游5-TTGTAGTTGAGAAAGG-3，卑劣5-GGGGTTGGTATATATGTGG-3；-atin(619bp)上游:5-GTGGTGGTGTGAA-3，卑劣:5-GTAGAGATTTGT-3。反响条件：943分钟；9430秒;5830秒;724

7、5分钟，共30个循环；72延伸10分钟。PR产物用1.5%的凝胶电泳，紫外灯下不雅察并照相。统计学处置惩罚数据用SD表现,用SPSS12.0阐发，P0.05表现有统计学意义，P0.01表现有明显意义。效果细胞凋亡流式细胞仪检测效果0.05g/lHHT作用后0，6,12及24小时UTZ-1细胞的凋亡率别离为0.630.59，5.071.38，10.215.79，22.526.55，凋亡率随着时间的延伸而增高，差异具有统计学意义P0.01(图1A、B)。细胞内钙离子浓度的改变0.05g/lHHT作用4小时后,UTZ-1造就细胞内绿色荧光强度即显着增长，12小时达岑岭，厥后开始落落。统计学阐发资料表

8、白,参加HHT后的UTZ-1造就细胞内的a2+i与空缺比拟组比拟有明显性差异(P0.01)(表1，图2)。Table1.Flu-3/AfluresenefUTZ-1ellstreatedithHHT(略)细胞膜电位的变革正常UTZ-1细胞的外貌大多呈匀称的橙赤色,表现绿色荧光的细胞较少;而颠末HHT处置惩罚的细胞胞体增大、绿色荧光加强,表白细胞受到损伤其线粒体膜电位有所落落。HHT处置惩罚后细胞红、绿荧光值的比值和正常比拟组比力4小时后开始落落，8小时后较为显着，48小时后细胞凋亡测不出。统计学阐发表白0.05g/lHHT作用8小时后的UTZ-1造就细胞与空缺比拟组比拟差异具有明显性意义(P0

9、.01)(表2，图3)。Table2.Dynaihangefithndrialebraneptential()inUTZ-1ellstreatedithHHT(略)凋亡相干基因RT-PR效果UTZ-1细胞静息状态下内质网应激相干基因HP基因不表达，BIP,XBP1基因少量表达，0.050g/lHHT作用4小时后即开始表达加强，12小时达岑岭，24小时表达量落落，48小时测不出，各组与空缺比拟组比拟力差异具有统计学意义P0.01(图4A、B)。讨论高三尖杉酯碱(HHT)是我国自主研制乐成的高效抗白血病药物，重要通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,其确切机制是如今研究的热门。本实行应用流式细胞术检测U

10、TZ-1细胞凋亡的产生，且HHT引起UTZ-1细胞凋亡是时间依靠性的。我们进一步研究创造内质网在其凋亡历程中也发挥了紧张的作用。内质网相干细胞凋亡是差异于受体介导(TNFR,Fas)或线粒体介导DNA损伤的另一种新的细胞凋亡途径。内质网与细胞凋亡相接洽表如今两个方面；一是内质网对a2+的调控，二是内质网应激反响。大量实行表白，许多细胞在凋亡早期会出现胞质内a2+浓度敏捷连续的升高，这种浓度升高泉源于细胞外a2+的内流和胞内钙库如内质网的开释。相对高浓度的a2+一方面可以激活胞质中的钙依靠性卵白酶如钙卵白酶alpain，另一方面可以作用于线粒体，影响其通透性的改变，进而促进凋亡9，10。本研究以

11、Flu-3/A为指示剂,接纳激光扫描共聚焦显微镜法测定细胞内游离a2+,效果创造人UTZ-1细胞受HHT作用后4小时细胞内钙荧光强度开始增长,8小时后增高更为明显,12小时达岑岭，厥后开始落落，但仍高于静息状态，表白HHT作用后出现钙超载。本研究同时也以J-1作为指示剂，用激光扫描共聚焦显微镜法测定用药前后细胞线粒体膜电位的改变，效果表现用药后，线粒体膜电位连续落落。因此我们推测HHT作用于UTZ-1细胞，引起UTZ-1细胞内游离钙离子的早期升高，但终极导致细胞内钙库耗竭，线粒体膜电位的连续落落，细胞凋亡产生。内质网内错误折叠卵白质聚拢就会导致内质网分子朋友基因表达激活，当未折叠卵白质过分聚拢酿成有毒性时就会触发细胞凋亡。信号重要通过aspase-12下传。钙卵白激酶HP(/EBPhlgusprtEin)基因也到场内质网应激反响诱导细胞凋亡11-12。我们的效果表白，0.05