实验2-分离以尿素为氮源的微生物

1、第一章 微生物的利用实验2 分离以尿素为氮源的微生物课题背景：尿素是一种重要的农业氮肥。但是尿素不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨气以后，才能被植物利用。而土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。什么是尿素和脲酶？（NH2）2C=O +H2O脲酶2NH3 + CO2尿素：又称脲，是蛋白质降解的产物。脲酶：降解尿素的酶。如何筛选分解尿素的细菌？原理：培养基中的唯一氮源是尿素，只有能分解尿素的细菌（能合成脲酶）能够在该培养基上正常生长和繁殖。碳源氮源实验原理利用将尿素作为唯一氮源的选择培养基分离出能利用尿素的细菌，再通过稀释涂布分离法，将该菌分散开来，以形成单菌落。

2、 细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使 pH 升高，碱性增强，使酚红指示剂变红。酸碱指示剂：酸黄碱红例题：下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（ ）A. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水 C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水D. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水选择培养基：只能以尿素为唯一氮源。实验设备及用品三角瓶、试管和试管架、培养皿、超净台、移液器、玻璃刮刀、酒精灯。从土壤中采集微生物土壤采样

3、方法：用小铲子去除5 cm表土，取离地面5-15cm处的土样1克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧。从有哺乳动物排泄物的地方取得稀释涂布分离法玻璃刮刀Step1：培养基的配制和灭菌全营养LB培养基/25mL尿素培养基/25mL 蛋白胨 0.25g酵母提取物 0.12gNaCl 0.25g琼脂糖 0.5g水 25 mL葡萄糖 0.025gNaCl 0.12gK2HPO4 0.12g酚红 0.25g琼脂糖 0.5g水 15mL尿素溶液 10mL特别注意：尿素溶液用G6玻璃漏斗过滤，使之无菌。Step2：倒平板将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯火焰旁分别倒入培养皿中，在超净台上摇匀，平放至

4、凝固。冷却至60Step3：制备细菌悬液1g 土样99 mL 无菌水10-2稀释液10-3、10-4、10-5稀释液怎样梯度稀释菌液？高浓度低浓度，换枪头微量移液器平行重复每一个稀释度的菌液：接种到3个培养皿中。Step4：用涂布分离法分离细菌全营养LB培养基（对照组）尿素培养基（实验组）10-310-410-5需要倒3个LB平板，9个尿素平板重复1 重复2 重复3重复1 重复2 重复3重复1 重复2 重复3取10-3、10-4和10-5的土壤稀释液各0.1 mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中。在酒精灯火焰旁打开培养皿，用玻璃刮刀将菌液涂布到整个平板上。70%酒精恒温培养箱Ste

5、p5：恒温培养箱中37培养培养皿要倒置将培养皿倒置，在37恒温箱中培养2448 h。实验结果：全营养培养基中有较多的菌落，而尿素培养基中只有少量的菌落。Step6：观察培养基中的菌落数Step7：统计菌落数目统计菌落数目：选择菌落数在30300的平板计数。每个稀释度取3个平板取其菌落的平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。例题：用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是（ ） A. 涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B. 涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别

6、是21、212和256，取平均值163 D. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233例题：稀释涂布平板法分离纯化土壤中微生物的正确操作步骤是（ ）土壤取样称取10 g土壤加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，制备土壤提取液吸取0.1 mL溶液进行平板涂布依次稀释至101、102、103、104、105、106、107的稀释度 A B C D思考与练习（1）为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？（2）有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？（3）有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？（4）与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？琼脂是未被

7、纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。能将尿素转化为氨，供植物利用，而对生态系统中N元素的循环有重要作用。细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使 pH 升高，使酚红指示剂变红。能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量。例题：（2012浙江高考）幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：请回答：（1）在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现色环带。（2）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是灭菌。A.高压蒸汽 B.紫外灯照射C.70%酒精浸泡 D.过滤

8、脲酶红（3）步骤X表示。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液到培养基平面上。菌液稀释的目的是获得菌落。（4）在培养时，需将培养皿倒置并放在中。若不倒置培养，将导致。（5）临床上用14C呼气实验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的分解为NH3和14CO2。接种涂布单（个）恒温培养箱无法形成单菌落尿素倒平板平板划线分离练一练，识一识稀释涂布分离接种环玻璃刮刀例题：（2011新课标全国卷）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于培养基。（2）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即和。（3）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，