微生物诊断专业技术标准课件

1、微生物感染的诊断技术天津医科大学医学检验学院 学习内容免疫学技术分子生物学技术细菌检验的自动化参考书Microbiology Nina Horne, Samuel Subity Textbook of medical microbiology and parasitology Kenneth J. Ryan 科学出版社临床微生物学与微生物检验 张卓然 主编 人民卫生出版社细菌感染的实验诊断感染性疾病的实验诊断涉及微生物学、免疫学、生化、临床抗生素学、医院感染学、流行病学。临床细菌实验室主要工作从临床标本中分离出病原菌，并进行准确鉴定，同时指导临床合理用药。 细菌感染的实验诊断临床诊断目的：1）

2、以疾病的病原学诊断为目的，一般鉴定细菌种类，必要时进一步鉴定。2）为提供治疗方案为目的，进行临床标本的直接药物敏感试验，还可根据病原菌的种类直接提供抗生素的范围和种类。3）以流行病学研究为目的，对病原菌做进一步鉴定，往往鉴定到型。4）了解细菌与感染的关系，感染的类型以及细菌的种类并非具有专一性。 第一部分 免疫学技术免疫学鉴定和免疫学诊断免疫学鉴定-用已知的抗体检测标本中或分离培养物中的未知病原生物，确定生物的种或型。免疫学诊断-用已知的病原生物或其特异抗原检测患者血清中相应的特异抗体及效价的变化。 一、凝集反应1 玻片凝集反应，用已知抗体的诊断血清，在玻片上直接与细菌培养物或细菌悬液混合，若

3、有与抗体相应的细菌，出现肉眼看见的凝集块或颗粒。2 反向间接凝集试验，将已知的细菌抗体直接吸附或通过化学偶联方法结合于RBC表明，制成抗体致敏细胞，再与被检物混合。一、凝集反应3 乳胶凝集试验，将已知的抗体吸附在聚苯乙烯颗粒上，可与相应抗原产生肉眼可见的乳胶凝集现象，借以坚定细菌。4 协调凝集试验，金黄色葡萄球菌细胞壁中的A蛋白（SPA）能够与人或哺乳动物的IgG-Fc段结合，使Fc暴露于葡萄球菌的表面，保留其抗体活性和特异性。当金黄色葡萄球菌与已知的IgG抗体连接时，成为致敏的颗粒载体，与相应抗原或细菌接触时，则出现肉眼可见的凝聚现象，借以证明相应的细菌或抗原的存在。二、免疫荧光技术1 直接

4、法，将已知抗体用化学方法结合荧光素制成荧光抗体，以此来浸染固定在玻片上的未知细菌。2. 间接法，将已知抗体与待检细菌标本充分反应后加入荧光素标记的抗IgG抗体，形成抗原-抗体复合物，可与随后加入的荧光标记IgG抗体进一步结合而固定于玻片上，在荧光显微镜下可见荧光出现。二、免疫荧光技术3 免疫荧光菌球法，荧光抗体直接染色与增菌培养相结合的方法，培养基中加入一定量的荧光抗体，然后接种标本，若有相应的病原菌，抗体与之结合而凝聚，聚会后得到的细菌继续增殖而聚合成团，在荧光显微镜下称绒球团样荧光。Enzyme-Linked Immunosorbent AssayIndirect ELISA Use to

5、 test Ab Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Sandwich ELISA Use to test Ag Direct ELISA1. Enzymology: Modifying enzymes (1)DNA polymerases (synthesize DNA)DNA ligases (join DNA strands by forming a phosphodiester bond)Kinases (phosphorylation of 5-terminus of DNA molecule)第二部分 分子生物学技术Enzymology: Restr

6、iction endonucleases BamH1 GGATCCCCTAGGHaeIIIGGCCCCGGCohesive Ends(5 Overhang)Cohesive Ends(3 Overhang)KpnI GGTACCCCATGGBlunt Ends(No Overhang) Enzymology: Restriction endonucleases GATCCTAGDpnI(Requires methylation)Methylation-sensitive EnzymesGGCCCCGGHaeIII(Inhibited by methylation)CCCGGGGGGCCCXma

7、I(59 Overhang)CCCGGGGGGCCCSmaI(Blunt Ends)IsoschizomersEnzymes GeneratingCompatible Cohesive EndsGGATCCCCTAGGBamHI(59 Overhang)AGATCTTCTAGABglII(59 Overhang)CTCGTGGAGCAGBssSI(59 Overhang)NNCAGTGNNNNGTCACNNTspRI(39 Overhang)Enzymes RecognizingNon-palindromic Sequences1. PCR AmplificationPolymerase Ch

8、ain ReactionThe polymerase chain reaction (PCR) is a technique for the in vitro amplification of specific DNA sequences by primer extension of complementary strands of DNA PCR Amplification: Amplification Approaches to amplificationWanted a way to generate large amounts of DNA from a single copyInit

9、ially used the “3 graduate student” methodDenaturingAnnealingExtending PCR Amplification: An overview Mechanism of PCRTarget SequencePCR Cycling Taq PolymerasePCR Cycling Taq PolymerasePCR products PCR Amplification: An overview PCR cyclingAdditional Cycles of AmplificationPrimer 1Primer 2Cycle 1Cyc

10、le 2Cycle 3 PCR Amplification: PCR reaction (2)PCR componentsDNA polymerase (Taq) dNTPsReaction bufferPrimers (1525 bp)Target DNA (ssDNA)PCR Thermocycler PCR Amplification: PCR reaction PCR cyclingssDNAannealingdsDNAdenaturationPrimer hybridizationPolymerase/DNA synthesisextension1 PCR Cycle(1530 se

11、c each)94 C5060 C72 C PCR Amplification: PCR reaction Standard PCR reaction 25100 ng DNA template 50 mM KCl 10 mM Tris HCl (pH 8.4) 1.5 mM MgCl2 gelatin 0.25 mM each primer 200 mM each dNTP 2.5 U Taq polymerase 3. PCR AmplificationDiagnostic PCR amplificationfrom patient samplesNegativePositiveSpeci

12、men 1Specimen 1Specimen 2Specimen 2DNA MarkerBlankNegativePositiveSpecimen 2Specimen 1EBV-Actin Hybridization Methods: ConceptHybridization is the process where a piece of nucleic acid is incubated with its complementary strand, either in solution or with one strand on a solid support, and the two s

13、trands bind together by hydrogen bonding Hybridization Methods: ConceptHybridization can be between DNA and DNA, DNA and RNA, RNA and RNA, or either nucleic acid and synthetic oligonucleotids Southern blot: the procedure for transferring denatured DNA from an agarose gel to a nitrocellulose filter w

14、here it can be hybridized with a complementary nucleic acidHybridization Methods: Southern blot Southern Blot AnalysisHybridization Methods: Southern blot Southern Blot AnalysisVacuum or capillary action: DNA is denatured in situ (in the gel) DNA fragments transferred from gel to solid supportLarge

15、fragments transfer slower than small fragmentsGel treatment: Depurinate with weak acid (reduces fragment size and increases transfer efficiency Denature with strong base, NaOH (hydrolyzes phosphodiester backbone at depurinated sites)Hybridization Methods: Southern blot Southern blot analysis of geno

16、mic DNA23.19.46.6第三部分 细菌检验的自动化一、微生物鉴定系统发展概况60年代细菌鉴定方法（手工配制的试剂培养坚定细菌生化反应）。70年代根据细菌生物学性状和代谢产物的差异，发展了微量快速和生化反应系统，具有简易化、微量化、系统化、商品化和标准化等优点，并实现了从生化模式到数字模式的转化。形成自动化微生物分析系统。细菌鉴定自动化组别试验项目代码结果结果代码总值1葡萄糖酸盐笨丙氨酸硫化氢124+-10012枸橼酸盐甲基红靛基质124+-12 03 数字编码鉴定法二、微生物数码分类鉴定系统 采用标准化、商品化和配套的生化反应试剂条（板），可将细菌鉴定到属、群、种和亚种或生物型，并可

17、对不同来源的临床标本进行针对性的鉴定。优点：简易化、微量化、系统化、商品化、标准化。（一）工作原理1数据库，由许多细菌条目组成。每个条目代表一个细菌种或一个细菌生物型。 2编码，将细菌生化反应模式转换成数学模式，可把生化反应结果快速转录成数字（编码），经查阅编码检索本或电脑分析系统又可将数字转化成相应的细菌名称（一）工作原理3查码 在编码检索本内寻找数码信 息：如菌名，鉴定结果的评价，生 化结果，阳性百分率，必须增加的 补充试验项目，指出注意要点等。（一）工作原理4解释如果排序第一的细菌id 80.0，则可按值的大小对可信度作出评价，如果第1条目的细菌id 80.0，就将前3个条目加在一起；若

18、还不足80.0，则此结果是不可接受的，既不属于同一细菌种，又不属于同一细菌属 。（二）数码分类鉴定系统组成和操作 1数码分类鉴定系统由试剂条、添加试剂 及检索工具配套形成的鉴定体系。（1）试剂条：常用的生化反应有 发酵试验； 同化试验； 同化或发酵抑制试验； 酶试验； 其他传统的生化反。（二）数码分类鉴定系统组成和操作（2）添加试剂：有些试验经孵育后需添加试剂才能呈现颜色变化。添加的试剂有配套试剂盒或单种试剂。（3）检索工具：检索工具包括鉴定表、编码本和电脑软件，可供人工查阅鉴定结果或由电脑自动处理并报告。每盒试剂条中 均附有操作说明书，包括鉴定百分率表。 （二）数码分类鉴定系统组成和操作2操

19、作要点 （1）准备 1）标本经分离培养得到纯菌落。 2）借助涂片、染色镜检、氧化酶 等试验对被测菌进行初步鉴定， 以选择合适的试剂条。 3）挑选被测菌的纯菌落接种试剂条（二）数码分类鉴定系统组成和操作（2）接种 1）制备细菌悬液：挑取菌落按试 条要求用生理盐水制备菌悬液。 2）调整菌悬液浓度：按试条要求 调整至1.5亿ml（0.5麦氏单 位）。 3）接种的体积：注意接种后液面 要平，不凸起也不凹陷，否则 将影响观察结果。（二）数码分类鉴定系统组成和操作（3）观察及记录结果：接种后的试条 经35-37孵育18h观察结果， 并在报告单上记录结果 。（二）数码分类鉴定系统组成和操作（4）结果的解释

20、依据是鉴定百分率表、编码本和电 脑软件，可将反应结果直接与百分 率表核对而得出结果，或将生化反 应的结果按3个一组得出数码，查阅 编码本即可得出解释。与电脑联机， 可半自动地得到鉴定的结果。ANOXOMAT MARK II 厌氧微需氧培养系统 三、微生物鉴定药敏分析系统（一）半自动微生物鉴定和药敏系统， 1VITEKATB l）原理：ATB鉴定系统是将肉眼观察的结果输人电脑，计算机数据库由许多细菌条目组成，将输人结果与数据库内细菌条目比较，自动地得到鉴定结果。结果判读为：敏感，中介或耐药。 三、微生物鉴定药敏分析系统2）仪器组成 由读数仪和电脑两部分组成。 电脑软件包括ATB和API的鉴定数

21、据库和ATB的药敏数据库，数据储 存、分析系统以及药敏专家系统。 3）操作方法：标本得到纯菌落。进行初步鉴定选择试剂条。按试条要求制备菌悬液。接种试剂条经35孵育18小时观察结果。将结果输人电脑，得到鉴定结果。三、微生物鉴定药敏分析系统4）特点： ATB系统是由API金标准改良而成， 拥有庞大的细菌资料库,可鉴定550 种细菌。 ATB系统操作方便，只需输入培养 结果，即可得到结果。三、微生物鉴定药敏分析系统2Microscan Panell）原理：使用测试板及快速接种系 统，人工判读，将编码结 果输人电脑，由电脑软件 得出反应结果。2）操作方法：与ATB相似。3）特点：操作简便，价格便宜。（

22、二）自动微生物鉴定药敏系统1.Autoscan.4 自动微生物鉴定/药敏分析仪 （1）原理：试剂板在培养箱孵育，然后放主机， 用比色法及比浊法对鉴定及药敏（MIC）进 行测定，96条不同波长光导纤维同时测定。 （2）仪器组成：主机，电脑和打印机。 （3）操作方法：将菌液加人试剂板，孵育24小 时。放入主机仪器自动判读结果。（4）特点：自动判读结果，操作简便。 2Auto Reader自动微生物鉴定药敏分析仪（1）原理：用荧光检测技术，在测定板 底物中加人酶介物，使其与 细菌生长中的酶结合生成荧 光物质。荧光物质通过荧光 读数仪得出的生物编码来判 定菌种。（2）仪器组成：主机，电脑。 2Auto

23、 Reader自动微生物鉴定药敏分析仪（3）操作方法：将菌液加入试剂板， 孵育24小时。将试剂板放入主 机仪器自动判读结果。（4）特点：可同进行鉴定和药敏， 自动判读结果，操作简便。（三）全自动微生物鉴定药敏系统1VITEK系统 自动微生物鉴定仪（AMS） 可做各种细菌的鉴定和药敏试验， 包括各种肠杆菌科细菌，非发酵细 菌，革兰阳性球菌，革兰阴性球菌， 厌氧菌及酵母菌的鉴定以及对引起 尿路感染的9种最常见的细菌鉴定 和计数。（三）全自动微生物鉴定药敏系统（l）原理：采用数码鉴定原理。组成 数据库自动打印实验报告 和病人报告单。（2）分型：分为Vitek-32，读取32片 试验卡。 Vitek-

24、60，容纳60片试验卡。 Vitek-120，容纳120片试验卡（3）仪器组成： 充填机封口机； 读取器恒温箱； 电脑主机； 终端机； 打印机； Vitek120。（三）全自动微生物鉴定药敏系统（三）全自动微生物鉴定药敏系统（4）配套试剂： 配套鉴定和药敏测试卡。（5）操作方法： 稀释尿标本或准备好的细菌悬液，接种后封闭卡孔，放入读取器恒 温箱，于35孵育，每隔一小时读卡1次，于4h内打印出结果。（三）全自动微生物鉴定药敏系统（6）仪器特点： 自动化； 快速，肠杆菌6h。 准确； 报告完整，包括菌名、最 小抑菌浓度（MIC）及成人 用药剂量。3Sensititre全自动微生物鉴定药敏分析仪（1

25、）原理：细菌鉴定：利用细菌生 长产生酶的特性，加人酶介质， 使其与细菌生长中的酶结合生成 荧光物质。在较短的时间判定菌 种。药敏试验原理：人工判定 时为比浊法，仪器自动判读时为 荧光测定法。3Sensititre全自动微生物鉴定药敏分析仪（2）仪器组成： 孵育箱及读数仪：同时检测 192个菌种样本。自动孵育， 读数。 电脑主机：采用最先进稳定 的UNIX系统作为操作平台。3Sensititre全自动微生物鉴定药敏分析仪（3）反应板： 鉴定板：革兰阴性菌，革兰阳 性菌，厌氧菌、苛氧菌及真菌 的鉴定板。 药敏板可提供近300种不同组合 的抗生素板。（4）操作方法：制备菌液接种，孵育 读数。四、微生

26、物自动鉴定药敏分析系统展望微生物鉴定和药敏分析系的要求：快速鉴定和药敏试验最好能在28h内完成。检测准确率高，能检测一般常规所有细菌，特别是葡萄球菌，非发酵菌和链球菌等,需提高检测的准确率和分辨率。四、微生物自动鉴定药敏分析系统展望自动化和电脑的智能化程度强，包括条形码识别功能，专家系统和便于网络化的数据分析和储存系统。成本更低，使中小型医院也能应用。 血培养系统1.菌血症是指细菌侵入血循环，并在其中生长繁殖，产生毒素引起的急性全身感染，常导致休克和多脏器衰竭。2.有关的微生物种类多，其毒力、致病性和耐药性各异，更增加了诊断和治疗的复杂性。因此，及时准确地获得结果尤为重要。3.近年来出现自动化

27、、电脑化的智能型血培养系统。一、血培养系统的发展概况自动血培养检测系统的基础是检测细菌和真菌生长时所释放的二氧化碳来作为有无微生物存在的指标。检测的技术有放射标记、颜色变化和荧光技术等。血培养瓶的种类增加以适应临床的各种需求，有需氧菌、厌氧菌、分枝杆菌、L型菌培养、抗生素瓶等。 二、仪器的基本结构与性能 (一）主机l恒温孵育系统，设有恒温装置和震荡培 养装置。2检测系统，自动血培养系统设有相应检 测系统。原理：（1）放射性14C标记法：活菌利用标记 底物产生14C。BACTEC仪分析培养瓶 中气体，14C标记CO2量超过界限时报 告阳性生长。（2）二氧化碳感受器：每一血液培 养瓶底部都含有No

28、vel颜色感应 器，当血液培养瓶内有微生物 生长释出之CO2后，感应器之酸 碱值也跟着改变，从深绿色变 为黄色，电脑报告阳性。 （3）均质荧光技术：在血培养基内含有发荧光物质。微生物生长代谢过程中产生各种带电荷的原子团，培养瓶发出的荧光，即可检测有细菌存在。判断并发出阴、阳性结果的报告，通过条形码识别标本编号，记录和打印结果。 三、配套试剂及操作要点1培养瓶有需氧培养瓶、厌氧培养 瓶等种类。（l）培养基营养成分：分离需氧及兼 性厌氧菌时，国内常用酚红肉汤。 分离厌氧菌时，在基础培养基中 再加人酵母浸膏。（2）抗菌药物桔抗剂：如加硫酸镁桔 抗某些抗生素。2真空采血系统配有一次性使用 的无菌塑料管，采得的血液因 负压作用进入培养瓶。3取血量 成人一次采血量为 5-6ml，婴幼儿为1-2ml。4采血方法应在发热高峰前1小 时,或抗菌药物应用之前