生化实验讲义血清蛋白page垂直板

1、血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Serum Proteins一、目的：1、掌握聚丙烯酰胺电泳基本原理；2、学会垂直板电泳的操作方法。二、原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场中对带电分子进行分离。聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体（简称Acr）、甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂四甲基已二胺（简称TEMED)和活化剂过硫酸胺（简称AP)作用下发生聚合反应而制得。 一般凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶，缓冲液是Tris-HCl pH6.8

2、；下层则是高浓度的小孔胶，称为分离胶，缓冲液是Tris-HCl pH8.9。 电泳槽中的电极缓冲液是Tris-甘氨酸，pH8.3。由此，凝胶浓度、缓冲液、pH不同，形成了一个不连续系统。 电泳时蛋白质样品放置在浓缩胶上，为观察蛋白质样品泳动的情况，样品中还加入溴酚兰染料，这些有色物质的分子比任何一种大分子物质泳动的速度都快。 三、实验试剂及仪器 凝胶贮存液（30% Acr-Bis）：称取29.2丙烯酰胺、0.8g N,N-甲叉双丙烯酰胺溶于蒸馏水中，定溶至100ml，4oC保存。分离胶缓冲液： 1.5mol/L Tris-HCL(pH=8.9)：称取18.17g Tris-base溶于蒸馏水中

3、，调pH8.9，定溶至100ml，4oC保存。浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCL(pH=6.8)：称取6.01g Tris溶于蒸馏水中，调pH6.8，定溶至100ml，4oC保存。10% APS: 称取1.0 g过硫酸胺(APS)溶于10ml蒸馏水中，4oC保存一周。电极缓冲液：0.025mol/LTris-0.192mol/L Gly。 称取3.03g Tris、14.4g甘氨酸溶于蒸馏水中，定溶至1000ml，4oC保存。样品缓冲液： 0.04%溴酚蓝-30%蔗糖：称取0.04g溴酚蓝，30g蔗糖溶于蒸馏水，dH2O 定溶至100ml, 4oC 保存。染色液：考马斯亮兰R-2

4、50 0.25g，加无水乙醇125.0ml，冰乙酸25.0ml，dH2O 定溶至250ml，4oC 保存。脱色液：含20%乙醇、5%冰醋酸的水溶液。 电泳槽、电泳仪、烧杯、量筒、手套等。四、操作：1、安装垂直玻璃板灌胶装置。2、配制凝胶溶液（两组共用；操作小心！），混合均匀。3、迅速灌制凝胶至接近满，并迅速插入梳子，放置30 min左右，能观察到凝胶的凝固状态。4、取出梳子，把含凝胶的玻璃板放在电泳槽中，固定好，加入电极缓冲液备用。5、取50倍稀释的血清20 ul，加样品缓冲液（溴酚蓝-蔗糖，蓝色）10 ul，混匀后取10 ul小心加到加样孔中。6、接通电源，开始电泳，电压约200V。7、指示剂接近凝胶前缘后，结束电泳，切断电源。8、小心取出凝胶，在玻璃培养皿中染色约20 min。染色液回收！9、脱色，观察染色的蛋白区带。注意事项:1、凝胶不要接触皮肤；2、小心使用玻璃板；3、注意防止触电！4、染色液不要洒到桌面、手上。 10%分离胶(10ml) 30%Acr-Bis 2.50 m