2022年一种高特异性和灵敏性的HBVcccDNA检测方案研究

1、一种高特异性和灵敏性的 HBV cccDNA检测方案争论陈 敏1,王永忠 1,江培学 2,张继明 3（213001 江苏 常州,常州市第三人民医院肝病争论所 1；202244 上海,上海复星医学科技进展有限公司 2； 202233 上海,复旦高校附属华山医院感染科 3） 摘要 目的 建立一种 TaqMan 探针的实时 PCR 检测乙型肝炎病毒共价闭合环状 DNA（ cccDNA ）方案；方法 依据 rcDNA与 cccDNA 结构差异,在缺口两侧设计引物,应用 TaqMan 探针分析,加入 1 种可以去除 rcDNA 和部分扩增产物的依靠 ATP 的内切酶（ Plasmid-Safe ATP-

2、depe ndent DNase）；结果 通过高速离心获得病毒单质颗粒验证了该方案的特异性；通过克隆和酶切得到 3.2kb 的环状 DNA 验证了方案的灵敏性；结论 胜利地建立了以 TaqMan 探针检测血清和肝组织 HBVcccDNA 的实时 PCR检测方法； 关键词 HBVcccDNA; 病毒单质颗粒；肝组织 中图法分类号 文献标志码 B 通信作者 张继明,电话：（ 021）52889999, E-mail ： 乙型肝炎病毒 HBV核酸检测是目前临床分析和 全部肝组织样本和血清样本的 DNA提取使用 Qiamp DNA 判定患者病程和传染性的重要依据之一；共价闭合环 Mini KitQIA

3、GEN GmbH,Germany ；肝组织样本重量不少于状 DNAcovalently closed circular DNA,cccDNA 10mg, 提 取 DNA 前 电 子 天 平 称 重 ；用 Plasmid-Safe 是HBV的原始复制模板,cccDNA的存在是病毒复制及 ATP-dependent DNase 处理提取的 DNA；感染得以维护的根源,抑制或清除 cccDNA是治疗慢性乙型肝炎 CHB的关键； 实时定量 PCR检测肝组织乙型 1.3 阳性对比肝炎病毒 hepatitis B 1-3 virus ,HBV、总DNAtotal DNA, tDNA和共价闭合环状 DNAc

4、ovalently closed 从未用抗病毒药物的慢性乙肝患者的血清中分别 HBV circular DNA,cccDNA 成为评判抗病毒药物疗效的 DNA,然后构建 HBV全基因质粒 pUC-536207（GenBank登录号金指标,也是目前肝病基础和临床争论的一个热点 1-2 ；AY220698,B基因型）；以此作为阳性对比；当前一些争论利用实时荧光PCR技术检测和定量1.4 阴性对比病毒中的 HBV DNA（放松环状 DNA, RC DNA）, 这些研究大部分只是检测患者血液中的 RC DNA,针对肝组织cccDNA争论很少 4-6 ；因此在乙肝抗病毒治疗中,急需通过滤膜和超高速离心制

5、备HBV病毒单质颗粒作为阴性对照；一种高特异性,高灵敏性,便利临床应用的能够真实检测 HBVcccDNA的方案；1.5 Plasmid DNA校正品的制备1 资料与方法考虑扩增效率等因素, 用于定量的校正品片段大小应当和1.1 争论样本cccDNA一样；取 HBV全基因 pUC-536207 质粒,通过酶切然后在 患 者 知 情 和 医 院 伦 理 委 员 会 核 准 下 , 收 集16 例连接制备成3.2kb 环状 DNA片段用以作为cccDNA定量校正品；2022-2022 年常州第三人民医院传染科住院的慢性乙型肝炎患1.6 内参者血清和肝移植组织,诊断符合2022 年 9 月“ 第十次全

6、国病GAPDH 基因作为人体内单拷贝数管家基因,它跟样本同时毒性肝炎及肝病学术会议” 所修订的病毒性肝炎诊断标准4 ；包括 E 抗原阳性患者11 例,其中男性患者8 例,平均年龄42检测来估测每个PCR反应中的肝细胞数目；扩增曲线见图1；岁；女性患者3 例,平均年龄36 岁；全部样本 -70 保藏；1.2 样本处理1 图 1 内参基因 GAPDH不同浓度扩增曲线图 3 1.5 10 2到1.5 10 8的同乙肝病毒等长度质粒片段的扩增曲线分析1.7 检测方法2.2PCR 特异性分析扩 增cccDNA 的PCR 引 物 序 列 是 ： HBV-1549, 5 -TCCCCGTCTGTGCCTTC

7、-3 ;HBV-1904, 5-CCCCAAAGCCACCCAA-3 ,在序列中的位置相应为15491565和 1904 1889. 荧 光 探 针 的 位 置 是： 5 -FAM-ATCTGCCGGACCGTGTGC-TAMARA-3 nt1567nt1582 ；详细位置见示意图 2；PCR反应条件： （1）预变性 94 4min ,（ 2）变性 94 15s ,退火与延长 60, 45s,共 40 个循环；血清 HBV DNA和肝组织 tDNA定量使用乙肝病毒定量检测试剂盒（复星诊断）；肝组织细胞数目通过内参GAPDH基因进行估测,中值确定为1 106 cells/mg；图 2 HBV c

8、ccDNA 引物探针位置示意图2 结果2.1 PCR 灵敏性分析HBV A-F 为了保证 PCR反应的灵敏性,引物设计时参考了cccDNA 引 物 的 特 异 性 通 过 扩 增 纯 病 毒 单 质 颗 粒 和Plasmid-Safe ATP-dependent DNase 处理来验证； 通过高速离心分别得到的病毒单质颗粒可以确认不会含有 cccDNA ；我们从文献 7 上找到基于 TaqMan技术检测 HBV cccDNA的方案作为比较； 依据文献 7 合成引物探针, 并用文献 7 供应的条件扩增病毒单质颗粒 DNA; 提取的 HBV病毒单质颗粒 DNA,依次稀释1.5 10 8到 1.5

9、10 6,同时跟我们的方案作比较,扩增图谱见图 2；我们的方案 3 个梯度的单质颗粒 DNA都没有扩增,而He 7 的方案 3 个梯度均有明显的扩增曲线；见图 4；由此可见,7我们试验方案有较好的特异性；通过 Plasmid-Safe ATP-dependent DNase 对肝组织和血清样本的消化处理确保 DNA引物的特异性； 酶处理前后肝组织和血清样本的 cccDNA拷贝数均显现变化,特别是血清样本,DNA拷贝数最多降低 4 个数量级（表 1）；8 个基因型的序列；酶切后与cccDNA 等长度的质粒片段通过图 4 不同 TaqMan PCR方案扩增 HBV ccc DNA的曲线分析罗氏试剂

10、定量后,从1.5 10 8 到 1.5 10 2, 依次 10 倍稀释,扩增如图 3；2.3 cccDNA 和 tDNA的检测结果2 我们对 16 例慢性乙肝患者的HBV DNA进行了检测,肝组以下的患者不能检测到cccDNA；Kock 等8 用乙肝病毒织和血清的 Total HBV DNA 以及 cccDNA 检测结果（表 2）；血清总 HBV DNA的水平分布在 5.42 10 4到 6.21 10 8 拷贝/ml ；16 例血清中有 9 例检测到了 cccDNA,浓度从 9.73 10 2 到2.69 10 4 拷贝 /ml ；样本 tHBV DNA 每 10 6 细胞的浓度水平从1.0

11、3 10 6 到 9.54 10 8 ；而检测样本 cccDNA 每 10 6 细胞的 HBV浓度水平从 4.49 10 4 到 9.53 10 7 ；血清总 HBV 去感染体外培育的 PBMCs时,发觉不能在细胞内检测到 cccDNA,相反, 假如转染的是肝细胞,就特别简单检测到 cccDNA；此外, 在乙肝患者的肝组织内,能检测到 cccDNA和 rcDNA,而在其 PBMC中,就只能检测到 rcDNA；这个观点同我们的争论一样；我们认为乙肝病毒是不能感染 PBMC,即使 PBMC中检测到乙肝病DNA水平也高于血清 HBV cccDNA水平,血清 cccDNA占总 HBV 毒,也只是血液的

12、病毒 DNA与 PBMC表面坚固结合,DNA的比例在 0.03% 0.81%之间；同时,肝组织的 HBV cccDNA 不易被 PBS等洗涤下来,抽提细胞所得到的病毒 DNA浓度水平相比更高,它与总 HBV DNA比例在 0.4%28%之间；其实并不存在于细胞内；或病毒仅仅是被 PBMC所“ 吸此外,管家基因 GAPDH的检测用来运算 PCR反应中细胞的数目；收”absorption,并没有建立真正意义上的感染状态 9-10 ；我们争论说明, HBeAg（+）慢乙肝患者的 cccDNA水平要高于 HBeAg阴性慢乙肝患者和 HBV携带者； 在表 1 Plasmid-Safe ATP-depen

13、dent 酶处理肝组织和血清样本的病毒量比较 全部 HBeAg（- ）患者肝组织中也均能检测到 cccDNA,这说明了为何 HBeAg阴性患者病情仍有可能显现进展肝组织 HBVDNA拷贝数 /10 6细胞 Serum HBV DNA拷贝数 /ml ）样本编号 HbeAg 特点 和恶化；事实上,HBV的复制和肝炎进展在整个自然DNase 处理 无 DNase处理 DNase 处理 无 DNase处理7 + 1.02E+08 3.35E+08 史中是反复波动的；即使 5.69E+04 9.32E+07 HBsAg清除的患者,在肝组15 + 7.65E+06 4.21E+08 织内仍可以检测到少量的

14、 8.23E+04 2.24E+08 cccDNA；19 - 7.80E+05 1.13E+07 ccc DNA 是乙肝病毒连续感染的关键因素,也是 1.12E+02 6.97E+06 26 - 6.21E+05 1.03E+06 HBV复制特异性指标,其精确性超过目前常用的 1.02E+02 5.42E+04 HBV 表 2 乙肝病毒 DNA的检测结果DNA检测；对于慢性 HBV感染者肝组织内 cccDNA的定血清 HBV DNA 拷贝数 /ml ）量检测可以作为监测抗病毒反应和打算治疗终点的 肝组织 HBVDNA拷贝数 /10 6细胞 样本编号 HBeAg 特点总 DNA cccDNA %

15、cccDNA 一个关键指标 总 DNA 11-13 ； ccc DNA 检测技术的完善和对3 + 1.36E+07 9.42E+03 0.6 cccDNA分子机制的进一步熟悉,有助于人们挖掘出针6 - 6.89E+06 对 HBV复制各个环节的抗病毒新药,9.2 达到削减耐药发7 + 9.32E+07 3.63E+04 0.3 生、削减复发和激活宿主免疫反应的目的；9 + 2.65E+07 6.02E+03 0.2 参考文献 : 8.74E+07 6.32E+06 7.2 12 + 6.21E+08 2.35E+04 0.03 9.54E+08 2.44E+07 2.5 1 韩思源 , 王燕

16、. 乙型肝炎患者血清中 HBV cccDNA、HBV DNA、 HbsAg与15 + 2.24E+08 2.05E+04 0.09 4.21E+08 1.05E+06 2.4 HbeAg定量关系的分析 J. 吉林医学 ,2022,32 （ 24）：5067-5068. 18 - 1.89E+06 7.53E+06 2.87E+05 3.8 2 张占卿 , 陆伟 , 张小楠等 . 肝组织 HBV总DNA和cccDNA阴性参考值的探讨19 + 6.97E+06 J.同济高校学报 ,2022,34:27-28. 1.13E+07 2.22E+05 1.9 20 - 6.32E+06 3 任伟宏 ,

17、赵素玲 , 李延卿等 . 乙型肝炎患者血清中 0.4 HBV cccDNA与HBV 21 + 1.02E+07 8.23E+03 0.81 DNA、HBsAg和HBeAg定量关系的分析 J. 3.08E+07 3.99E+06 检验医学, 2022,25 12.9 （6）:438-440. 22 + 8.54E+06 9.73E+02 0.11 1.91E+07 8.97E+05 4.6 4 Newbold J, Xin H,Tencza M.The covalently closed duplex form of the 24 - 1.13E+06 4.79E+06 1.27E+06 27

18、hepadnavirus genome exists in situ as a heterogeneous population of viral 26 - 5.42E+04 minichromosomesJ. J Virol 1995,69:3350-3357. 1.03E+06 2.54E+05 24 29 + 2.31E+07 1.23E+03 0.05 5 Wu T-T, Coates L, Aldrich CE.In hepatocytes infected with duck hepatitis 32 + 1.25E+08 2.69E+04 B virus, the templat

19、e for viral RNA synthesis is amplified by an 35 + 8.69E+06 1.74+03 0.2 intracellular pathwayJ.Virology 1990,175:255-261. 2.22E+07 1.43E+06 6.4 6 Jun-Bin S Zhi A quantitive method to detect HBV cccDNA bychimeric 3 争论primer and real-time polymerase chain 本争论对 16 例患者的外周血进行检测,其中 9 reactionJ.2022.J.Virol

20、.Meth,112:44-54. 7例检测到 cccDNA的存在, 且外周血 HBV DNA 1.0 103 7 He,M-L,Wu J.A new and sensitive method for the quantification of HBV cccDNA by real-time PCRJ. Biochem,Biophys,2022,295:1102-1106. 8 Kock,J,Borst E M,Schlicht H J. Uptake of duck hepatitis B virus into hepatocyes occurs by endocytosis but dose no