gg基因工程的操作程序课件

1、第二节 基因工程的基本操作程序第1页，共22页。基因工程的基本操作程序获取目的基因构建表达载体导入受体细胞目的基因检测与鉴定第一步第二步第三步第四步第2页，共22页。一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1. 基因组文库 将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。2. 部分基因文库 受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。第3页，共22页。3. 基因文库的构建（1）基因组文库的构建提取某生物全部DN

2、A用适当限制酶切割许 多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库第4页，共22页。（二）利用PCR技术扩增目的基因1. 原理 PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。第5页，共22页。2. 过程高温变性（9095）低温退火（

3、5560）中温延伸（7075） 双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。多次重复3.特点：指数形式扩增第6页，共22页。（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因DNA合成仪蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推测推测合成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。第7页，共22页。二、基因表达载体的构建 用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。（一）构建目的 使目的基因在受体细胞中稳

4、定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。第8页，共22页。质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA第9页，共22页。1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。 核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同基因表达载体的构建第10页，共22页。 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达

5、。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资 料:第11页，共22页。（二）构建零件及其作用1. 目的基因2. 启动子 RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。第12页，共22页。3. 终止子 一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。4. 标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目

6、的基因的细胞筛选出来。第13页，共22页。三、将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。 基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。 第14页，共22页。1.农杆菌转化法（一）导入植物细胞2.其他方法（见教材P12“生物技术资料卡”）（1）基因枪法（2）花粉管通道法第15页，共22页。（二）导入动物细胞显微注射技术含目的基因的表达载体动 物 的受 精 卵含目的基因的受精卵早 期胚 胎雌性动物输卵管或子宫转基因动 物显微注射分裂分化移 植发育第16页，共22页。（三）导入微生物细胞2. 常用受体细胞 大肠杆菌（E.c

7、oli）1. 过程（1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细胞，改变细胞膜的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（2）重组DNA分子与感受态细胞混合，完成转化。Ca2+ 处理法第17页，共22页。四、目的基因的检测与鉴定 目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。 常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。第18页，共22页。（一）分子水平1. 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 提取受体生物全部DNA适当限制酶切割DNA片段用同位素标记的目的基因片段杂交显 出杂交带（表明目的基因已插入）分子杂交技术第19页，共22页。2. 检测目的基因是否转录出了mRNA 提取受体生物的mRNA用同位素标记的目的基因片段杂交显 出杂交带（表明目的基因已转录出了mRNA） 检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。第20页，共22页。3. 检测目的基因是否翻译出蛋白质 抗原抗体杂交技术提取受体生物的蛋白质与相应抗