动物免疫学实验技术-补体结合反应技术

1、PAGE PAGE 15 第六章 补体结合反应技术（Complement fixation reaction technique）概况可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应就是补体结合反应。补体结合反应是一种古老的血清学技术，Bordet和Gengou在1901年设计这一试验，由于有敏感性高和适应性广的优点，尽管操作繁杂，目前仍被有效地应用。（一）补体及其作用特点补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最

2、高，成分较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。5630min可使补体失去活性，称为“灭能”或“非动”。补体的作用为能与抗原抗体复合物结合，但不能与抗原单独结合，也不易与抗体单独结合；补体的作用没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合。它能与红细胞（抗原）和溶血素（抗体）的复合物结合，引起红细胞破坏（溶血），也能与细菌、病毒成分及其相应抗体的复合物结合。（二）溶血反应将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家兔）可使之产生相应的抗体（溶血素），这种抗体与红细胞结合，若有补体存在时，则红细胞被溶解，这种现象称为溶血反应。红细胞和溶血素被称为溶血系统，常在补体结合反应中用作

3、测定有无补体游离存在的指示剂。（三）补体结合反应及其原理可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察。如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相对应的抗原和抗体。此反应即为补体结合反应。补体结合反应中的抗体主要是IgG和IgM。反应的原理在于补体本身没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合。以检查鼻疽病为例，先向试管中加入已知的抗原（鼻疽菌的浸出液），再加入被检马匹的血清（抗体）和豚鼠血清（补体），这三种成分称为反应系统或溶菌系统。如果该马是鼻疽病马，则血清中有抗鼻疽杆菌的抗体。抗原

4、和抗体发生结合，吸附补体。如果该马没有鼻疽病，血清中没有抗鼻疽菌的抗体，则不能形成抗原抗体复合物，不能吸附补体，则补体游离存在。由于许多抗原是非细胞性的，而且上述抗原、抗体和补体三种成分都是用生理盐水或缓冲盐水稀释的比较透明的液体，所以补体不论是否被结合，都不能直接看到，故无法判定。因此，在反应系统的三种成分作用一定时间之后，再向其中添加指示系统绵羊红细胞和特异性抗体溶血素。如果抗原和病马血清中抗体特异性结合，吸附补体，没有游离补体存在，加入指示系统，因无补体参加，不发生溶血，这种情况称为补体结合反应阳性，即该马患有鼻疽病；反之，则该马未患鼻疽病。(四) 补体结合反应的特点图6-1补体结合反应

5、原理示意图溶血系统待测系统不溶血（阳性）溶血（阴性）溶血（阴性)抗体红细胞溶血素补体抗体抗原溶血素补体红细胞红细胞溶血素补体补体结合反应操作繁杂，且需十分细致，反应的各个因子的量必须有恰当的比例。特别是补体和溶血素的用量。补体的用量必须恰如其分，例如：抗原抗体呈特异性结合，吸附补体，本应不溶血，但因补体过多，多余部分转向溶血系统，发生溶血现象。又如抗原抗体为非特异性，抗原抗体不结合，不吸附补体，补体转向溶血系统，应完全溶血，但由于补体过少，不能全溶，影响结果判定。故补体量必须恰如其分。溶血素量也有一定影响，例如阴性血清，应完全溶血，但溶血素量少，溶血不全，可被误认为弱阳性。另外，这些因子的用量

6、又与其活性有关：活性强，用量少；活性弱，用量多，故在本试验之前，必须精确测定溶血素效价、溶血系统补体价、溶菌系统补体价等，测定其活性以确定用量。（五）补体结合反应的应用补体结合反应是诊断人、畜传染病常用的血清学诊断方法之一。本法不仅可用于诊断传染病，如鼻疽、牛肺疫、马传染性贫血、乙型脑炎、布氏杆菌病、钩端螺旋体病、血锥虫病等，也可用于鉴定病原体，如对马流行性乙型脑炎病毒的鉴定和口蹄疫病毒的定型等。经典补体结合反应（以马鼻疽补反为例）（一）预备试验1绵羊红细胞悬浮液的制备 通常用公绵羊红细胞，将绵羊血液采集于带有玻璃珠的无菌容器中，充分振摇，使脱去纤维，此时血液失去凝固性，称脱纤血。亦可用阿氏液

7、保存血液，阿氏液配方如下： 葡萄糖 24.60g 氯化钠 5.04g 柠檬酸钠（含2个分子结晶水） 9.60g 蒸馏水 1 200ml溶液配好后，高压（10磅）灭菌10min，也可通过蔡氏滤器灭菌。溶液盛于瓶内，将绵羊血直接采入瓶内，血量应大致与阿氏液量相等。摇匀，置冰箱中保存，可保存3周左右。用时将血液移入离心管内，加35倍量生理盐水，离心沉淀洗涤三次，每次2 000rmin，离心10min，然后去掉上清液，血球泥用生理盐水配成2.50液应用。2溶血素效价测定 溶血素是用绵羊红细胞，经多次免疫家兔，抽取家兔血清，加入甘油而成。在冰箱中可保存二年以上。每隔两、三个月测定效价一次。溶血素可从生物

8、制品厂购买。溶血素效价测定的方法：先将溶血素稀释成100倍，即0.20ml的溶血素（溶血素实量含0.10ml）加入9.80ml生理盐水混合即可。然后按表61配成稀释液：表6-1溶血素稀释表稀释倍数1 0001 2001 5001 8002 0002 5003 0003 5004 0001100溶血素生理盐水全量0.100.901.000.101.101.200.101.401.500.101.701.800.101.902.000.102.402.500.102.903.000.103.403.500.103.904.00另取小反应管一列，按次序从每一稀释液取0.50ml分别加入各管中，添加时

9、应由稀释度大的稀释液加起，这样可不必更换吸管。然后再加入生理盐水1.00ml，120补体和2.50红细胞悬液各0.50ml。在37水浴槽中放20min后判定结果。详细操作程序见表6-2。表6-2 溶血素效价测定示例稀释倍数1 0001 2001 5001 8002 0002 5003 0003 5004 000溶血素对照补体对照血球对照溶血素0.500.500.500.500.500.500.500.500.500.50生理盐水1.001.001.001.001.001.001.001.001.001.501.502.001:20补体0.500.500.500.500.500.500.500.

10、500.500.502.50红细胞0.500.500.500.500.500.500.500.500.500.500.500.5037水浴20min结果全部溶血部分溶血不溶血试验中发生全部溶血的溶血素最大稀释倍数（即12 000），微溶血素的效价，亦称一个溶血单位。做正式试验时，溶血素按二个单位稀释使用。在本例中，其使用浓度应为11 000。3补体的效价测定 取健康豚鼠3只以上，饲喂前，每只从心脏取血8ml15ml，注入培养皿内，放入37温箱内30min，取出置4冰箱内，待血清析出后，吸入离心管中，3 000rmin离心15min，取上清趁新鲜稀释使用。如一次采取大量补体，可定量（1ml2ml

11、）分装于青霉素瓶内，置低温冰箱冻结保存。避免反复冻融。也可从兽药厂购买冻干补体，在冰箱内可保存三年。 测定和使用补体时，按表6-3进行。表6-3补体效价测定表试管号1234567891011对照120补体0.100.130.160.190.220.250.280.310.340.370.40生理盐水0.900.870.840.810.780.750.720.690.660.630.601.00一个工作量抗原0.500.500.500.500.500.500.500.500.500.500.500.50 37水浴20min致敏血球1.001.001.001.001.001.001.001.001

12、.001.001.001.00结果部分溶血全部溶血不溶补体效价测完后，按表添加各种成分。所用的致敏血球是将2单位溶血素和2.50红细胞液等量混合后，置37水浴中15min，即成为致敏血球。在2单位溶血素的存在下，能使0.50ml的2.50红细胞完全溶血的最小补体量，即为该补体的效价。在本例中，补体效价为1:20稀释液0.25ml。效价测完后，按下列计算原补体在使用时应稀释的倍数。 0.500.2520.040.00即此补体应作140稀释使用，每管加入0.50ml，此即为1个单位补体。考虑到补体性质不稳定，在操作过程中效价会降低，故此使用浓度比原效价大10.00左右较为适宜。因此，本批补体应用1

13、36稀释使用，每管加入0.50ml。4抗原效价测定 鼻疽补体结合反应抗原是用强毒鼻疽杆菌的混悬液，经高压灭菌，并在冷处浸泡取其滤液制成的。鼻疽抗原可向兽药厂购买。使用时按出厂使用说明书或标签标明的效价稀释应用。如因保存时间过久或其它原因，抗原效价可能发生变化，使用前加以滴定。抗原稀释：用生理盐水将抗原原液作成9种稀释液，方法如表6-4。表6-4 抗原稀释表管号123456789稀释倍数1.004.002.003.003.002.001.501.001.503.004.006.5013.51.001.001.509.001.00105075100150200300400500生理盐水（ml）抗原

14、（ml）实存量（ml）6.505.007.506.504.504.004.504.005.00 血清稀释：取鼻疽强阳性血清和弱阳性血清各一份，用生理盐水按表6-5做成5种稀释液，在60水浴中灭能30min。表6-5 鼻疽阳性血清稀释表稀释倍数10255075100生理盐水(ml)9.009.609.807.409.90血清（ml）1.000.400.200.100.10操作法：按表6-6进行。摆12排反应管，由左向右加入不同稀释度的抗原0.50ml。然后再由上向下，第一排的9个试管各加入110灭能的阴性马血清0.50ml。第二排的9个试管各加入生理盐水0.50ml。第三排至第七排试管分别加入不

15、同稀释度的强阳性血清0.50ml。第八排到第十三排再分别加入不同的稀释度弱阳性血清0.50ml。所有试管加入一个单位补体0.50ml，混匀后置37水浴箱20min取出，每管加致敏血球1.00ml，摇匀后，置37水浴20min，取出，观察反应结果。表6-6 抗原效价测定表抗原稀释倍数105075100150200300400500抗原(ml)0.500.500.500.500.500.500.500.500.5稀释血清（ml）0.500.500.500.500.500.500.500.500.50补体（ml）0.500.500.500.500.500.500.500.500.5037水浴20mi

16、n致敏血球（ml）1.001.001.001.001.001.001.001.00 1.0037水浴20min抗原效价测定的结果根据溶血百分数来判定表6-7 抗原效价测定结果示例抗原稀释105075100150200300400500阳性血清1:10000001030305001:25000002040401001:5010000103050501001:755020100205070701001:1008080706090100100100100表注：表中0100均为溶血的百分比表6-7是一份强阳性血清测定结果的一个示例。按比例，抗原1100稀释液与强阳性血清的各稀释度所发生的抑制溶血现象最

17、强。如果对弱阳性血清的各稀释液的反应亦与此相同，则此批抗原的效价为1100，这就是一个抗原工作量。应注意，测定抗原必须用病马阳性血清，不可使用注射鼻疽死菌免疫的兔高免血清。5待检血清和对照血清 对照用鼻疽阳、阴性血清可于兽医生物制品厂购买，也可自送检血清中选取。待检血清采血时，最好在早饲前或在停食后6h，以免血清混浊。采血后，趁血未凝固，将试管斜置，使其凝成斜面。凝固后将试管置于温暖处，使血清析出，经过10余小时，将血清倾入另一干净无菌试管中。如血清析出不良时，可用镍线将血凝块划破，并使之从管壁脱离，放于冷暗处，使血清充分析出。血清采后最好于1天内送到实验室，最迟不超过3天。若3天内不能送到，

18、应加防腐剂。通常加0.50石炭酸防腐。试验前，用生理盐水将待检血清稀释10倍，然后在水浴槽内加温灭能30min，马血清加温到60。驴、骡血清为6364。灭能不但能消除血清中的补体和抗补体作用，且能使它在反应中作用趋于稳定。（二）本试验预备试验完毕之后，即可进行本实验（参见表6-8）。待检血清作110稀释，分装两管，各0.50ml。其中一管加抗原，一管不加抗原，作为血清抗补体对照。对照血清用阳、阴性血清各一份。补体加一个单位0.50ml。混合后，置37水浴中20min。取出后，所有试管加致敏血球1.00ml，混匀、再于37水浴中放20min。取出后，判定结果。表6-8鼻疽补体结合反应本试验操作程

19、序试验管待检血清阳性血清对照阴性血清对照抗原对照补体对照 试验 对照1:10血清0.500.50 0.500.50抗原(一个工作量)（ml）0.500.500.500.50补体(一个工作量)（ml）0.500.500.500.500.500.5生理盐水（ml）0.500.501.00 37水浴20min致敏血球（ml）1.001.001.001.001.001.00 37水浴20min 结果（例）符号记载说明： ： 90100抑制溶血。 ： 5090抑制溶血。 ： 3050抑制溶血。 ：1030抑制溶血。 ：010抑制溶血。试验结果：阳性血清对照管必须100抑制溶血，方认为正确。观察反应可使试

20、验结束后进行第一次判定，先将阴性血清判定完。其余血清，可放暗处数小时，待红细胞下沉后，再作第二次判定，较为方便。在马鼻疽，若反应为“”或“”时，可判为阳性；若为“”或“”时判为可疑；若为“”时判为阴性。为了判定上的方便，可制出标准溶血管。其制法为：取在本试验中使用的2.50红细胞混悬液5ml于离心管中，离心沉淀，去上清液，加入20ml蒸馏水，用力振摇，使红细胞完全溶解，再加入5ml 4.50氯化钠溶液，此为100溶血液。取本试验用的2.50红细胞混悬液5ml，于20ml生理盐水混合，此为100不溶血的红细胞混悬液。取11支反应管，其管口粗细应与所用的反应管相一致。按表6-9加入上述两种成分。表

21、6-9标准溶血管配制试管号1234567891011100溶血液2.001.801.601.401.201.000.800.600.400.2100不溶血混悬0.200.400.600.801.001.201.401.601.802.10溶血1009080706050403020100相当于抑制溶血0102030405060708090100微量补体结合反应（以钩端螺旋体病为例）本试验采取热法血清稀释法。每滴相当于0.02ml，总量为6滴，相当于0.12ml。抗原 系各型菌株培养物多价抗原，按瓶签说明倍数稀释。2溶血素 正式试验时使用2个工作单位。3补体系冻干补体 用灭菌生理盐水作15基础稀释

22、。在溶血素效价测定和补体效价滴定时均作160稀释，在正式试验时，用2个工作单位。41的红血球悬液，用灭菌生理盐水洗涤与配制。在使用时与等量含2个工作单位的溶血素液配成致敏红血球悬液。5阳性血清 正式试验时1100稀释。6阴性血清 正式试验时110稀释。7生理盐水（二）预实验1溶血素效价测定 用小试管做时，单位为ml；用血清稀释板做时，单位为滴。溶血素稀释：先将溶血素做11 000基础稀释。见表6-10。表6-10溶血素稀释表（单位：滴）稀释度1:1 0001:2 0001:3 0001:4 0001:5 0001:6 0001:7 0001:8 000生理盐水1:1 000溶血素1112131

23、41516171溶血素效价测定 见表6-11。表6-11溶血素效价测定表(单位：滴)1:1 0001:2 0001:3 0001:4 0001:5 0001:6 0001:7 0001:8 000溶血素111111111:60补体22222222生理盐水222222221红血球悬液11111111置微型振荡器震荡3min5min后，放37水浴10min溶血程度举例根据上述结果,溶血素效价为15 000即为一个工作单位。2个工作单位溶血素为12 500稀释度。2补体效价测定补体稀释，见表6-12。表6-12补体稀释表（单位：ml）管号1234567891011121:60补体0.050.080.

24、100.120.140.160.050.080.10.120.140.16生理盐水0.250.220.200.180.160.140.250.220.200.180.160.14补体效价测定,见表6-13。表6-13补体效价滴定表(单位：滴)补体333333333333抗原111111生理盐水111111置微型振荡器3min5min后，放入37水浴10min1致敏红血球222222222222振荡3min5min后，放37水浴10min溶血程度(举例)表注：1号6号不加抗原，712号加抗原，当结果不一致时,以加抗原的结果为准。以2个单位补体稀释度计算。按上表所示，在两列中达到完全溶血（）时，最

25、小补体量160稀释为0.12ml，（即为第四管与第八管）做为1个补体单位。在抗原效价测定和正式试验时，使用补体0.20ml中应含2个单位补体。所以补体的稀释度应为：60（0.122）x0.20,x=50,即取1ml补体原液加49ml生理盐水即成。3抗原效价测定 新生产的抗原可按瓶签说明效价用，贮藏过久的抗原，应作效价测定后使用。抗原稀释：用血清稀释板做，见表6-14。表6-14抗原稀释表（单位：滴）抗原稀释度1:21:41:81:161:321:641:128抗原生理盐水2.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.00抗原

26、效价测定：见表6-15表6-15抗原效价测定表（单位：滴）抗原稀释度1:21:41:81:161:321:641:128对照抗原1111111阳性血清1:101:1001111111111111112单位补体22222222生理盐水2振荡3min5min，37水浴10min1致敏红血球22222222振荡35min，37水浴10min，判定结果。 3抗原效价测定 见表6-16。表6-16抗原效价判定表（例）抗原稀释度1:21:41:81:161:321:641:128对照阳性血清1:101:100+阴性血清生理盐水 以抗原的最高稀释度与最高稀释度的阳性血清呈完全抑制溶血者，作为抗原效价。按表6

27、-16，抗原效价为132，即在使用时将抗原以生理盐水作132倍稀释。阴性血清对照应完全溶血。抗原抗补体对照应不超过12稀释度，为合格。（三）本实验见表6-17。表6-17微量补反试验表（单位：滴）孔号1 234 56789被检血清1:10 1:20阳性血清1:100阴性血清1:10抗 原抗补体对照1:10被检血清抗补体对照1:10 1:20阳性血清抗补体对照1:100阴性血清抗补体对照1:10血清11111111抗原111112单位补体222222222生理盐水11111振荡3min5min，37水浴10min1致敏红血球222222222振荡3min5min，37水浴10min抑制溶血程度（

28、四）注意事项1结果判定时，完全透明为100溶血（），混浊为50溶血（+）时，判定以后者标准为依据。2抗原效价低于14时，不可使用。阳性血清效价低于1100（抑制溶血程度）者，不能用于抗原效价测定。但若抑制程度在+以上者，尚可供正式试验时阳性血清对照用。3V型血清板较U型血清板反应观察清晰。4由于血清板传热性能较差，所以感作时间应适当延长。一般以阴性血清对照孔完全溶血为止。固相补体结合反应（以固相反向补反检测脑炎病毒为例）（一）材料与试剂 1pH7.2巴比妥缓冲液氯化钠 85.00g巴比妥 5.75g巴比妥钠 3.75g氯化镁（MgCl26H2O） 1.88g氯化钙 0.28g H2O 加至 2

29、 000ml配制时，先将巴比妥溶于500ml水中，然后加入氯化钠和巴比妥钠，加水至2 000ml，最后加入氯化镁和氯化钙。高压灭菌后，置4保存，此为原液。应用时，以蒸馏水作1：5稀释，配成使用液，并测定使用液的pH值。如pH值过高则以巴比妥调节，过低则以巴比妥钠调节。21琼脂糖，并以0.10叠氮钠防腐。3绵羊红细胞4溶血素 要求效价在1.0104倍以上。5乙脑病毒P3株，其对小白鼠（8g10g体重）的MLD（脑内）为1.0010-90.03ml。6抗乙脑病毒抗体 是采用地鼠肾细胞培养的乙脑病毒物多次腹腔接种豚鼠而获得，补体结合反应效价达256以上为合格。应用前，需加入110量的新鲜补体液，37水浴感作1h，然后56感作30min以灭活补体。此过程是除去豚鼠血清中的抗补体成分。7正常豚鼠血清8塑料琼