H-脱氧-D-葡萄糖摄取测定方法检测心肌细胞对葡萄糖的摄取量

1、生理学报 Acta Physiologica Sinica, April 25, 2004, 56(2): 224-229 HYPERLINK Received 2003-07-29 Accepted 2003-09-19 This work was supported by the National Basic Research Priorities Programme of Peoples Republic of China (No. G2000056906) and the National Natural Science Foundation of China (No.30070872

2、). *Corresponding author. Tel: Fax: E-mail: zhangyy -肾上腺素受体激动对新生大鼠心肌细胞代谢的影响 闫 洁, 陈 锴, 徐 明, 吕志珍, 韩启德, 张幼怡* 北京大学第三医院血管医学研究所, 分子心血管学教育部重点实验室, 北京 100083 摘 要: 为了观察-肾上腺素受体 (-AR) 持续激动对心肌细胞代谢的影响, 本工作以培养的新生大鼠心肌细胞为研究对象, 采用3H-亮氨酸 (3H-leucine）掺入法和BCA蛋白分析法检测心肌细胞的蛋白合成代谢与蛋白含量, 3H-2-脱氧-D

3、-葡萄糖摄取测定方法检测心肌细胞对葡萄糖的摄取量, 并采用蛋白免疫印迹杂交方法检测腺苷酸活化蛋白激酶 (adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK) 磷酸化程度。结果显示, -AR激动剂异丙肾上腺素 (isoproterenol, ISO) 持续刺激心肌细胞48 h, 心肌细胞3H-leucine掺入量和蛋白质含量与对照组相比均无显著差异。用ISO或去甲肾上腺素(1-AR特异性拮抗剂哌唑嗪存在下)持续激动-AR 48 h, 心肌细胞的葡萄糖摄取量和AMPK磷酸化均显著高于对照组。上述结果表明, -AR持续激动对培养的新生大鼠心肌

4、细胞蛋白质合成及蛋白质含量没有明显的作用, 但可引起葡萄糖摄取量明显增加和AMPK的激活, 提示-AR可能与心肌肥厚过程中能量代谢状态的变化有关。 关键词: -肾上腺素受体; 代谢; 心肌细胞; 腺苷酸活化蛋白激酶 中图分类号: Q463 Effects of -adrenoceptor activation on metabolism in neonatal rat cardiomyocytes YAN Jie, CHEN Kai, XU Ming, LU Zhi-Zhen, HAN Qi-De, ZHANG You-Yi* Institute of Vascular medicine, p

5、eking university third hospital and Key Laboratory of Molecular Cardiology, Education Ministry, beijing 100083, China Abstract: The aim of the present study was to investigate the effects of -adrenergic receptor (-AR) activation on metabolism in cultured neonatal rat cardiomyocytes. The protein synt

6、hesis and total protein content of cardiomyocytes were determined by 3H-leucine incorporation and BCA protein content assay. Cardiomyocyte glucose uptake was measured by 3H-2-deoxy-D-glucose uptake analysis. Adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK) phosphorylation was detected by West

7、ern blot. The results showed that sustained stimulation with isoproterenol (ISO), a -adrenoceptor agonist, had no effect on 3H-leucine incorporation and total protein content in cardiomyocytes. With -AR activation by ISO or NE (pretreated with a selective blocker of the 1-adrenoceptor prazosin) for

8、48 h, both the glucose uptake and AMPK phosphorylation increased significantly compared with unstimulated cardiomyocytes. These results suggest that although sustained -AR activation has no effect on cardiomyocyte protein metabolism, glucose uptake and AMPK activity are increased significantly. The

9、role of these -AR activation-induced changes in cardiac hypertrophy remains to be further investigated. Key words: -adrenergic receptor; metabolism; cardiomyocytes; AMPK 肾上腺素受体 (adrenergic receptor, AR) 介导的儿茶酚胺效应在心脏收缩功能、心肌细胞生长与凋亡 的调节中起着十分重要的作用1。分布在心脏中的AR主要为1-AR和-AR。-AR在介导心脏功能中占主导地位，其激动后引起正性变力、变时和增加舒

10、张作用2。研究表明, -AR亦参与了心肌肥厚的发生, 长期应用-AR拮抗剂可以明显减少心力衰竭病人的死亡率 3。Eichhorn等研究发现, 给予充血性心力衰竭病人12周b1-AR拮抗剂美托洛尔治疗后, 心肌组织的脂肪酸氧化明显减少而乳酸的摄取和葡萄糖的氧 化明显增强, 心脏功能明显得到改善4。因此, -AR持续激动所引起的代谢改变在心肌肥厚发展和转归过程中可能发挥着重要作用, 但其作用机制尚不清楚。 为此, 本实验以培养的新生大鼠心肌细胞为研究对象, 通过观察心肌细胞3H-亮氨酸 (3H-leucine)掺入量及蛋白含量来反映心肌细胞蛋白代谢; 以心肌细胞对3H-2-脱氧-D-葡萄糖(3H-

11、2-deoxy-D-glucose, 3H-2DG) 摄取量反映其对葡萄糖的摄取情况; 并采用蛋白免疫印迹杂交方法观察了对代谢有重要调控作用的腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)活性的变化, 对-AR持续激动引起的心肌细胞代谢改变进行了初步探讨。 1 材料和方法 1.1 材料和试剂 去甲肾上腺素(norepinephrine，NE), 异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO), 哌唑嗪 (prazosin,Praz), 普萘洛尔(propranolol, Prop), Hoechest33

12、258,Anti-Sarcomeric a-actinin antibody均购自Sigma公司; 胰蛋白酶和DMEM购自Hyclone公司; 型胶原酶购自Worthington Biotechnology公司; 3H-leucine购自Amersham Biosciences公司；3H-2DG购自 Perkin Elmer Life Sciences公司；BCA protein assay reagent 购自Pierce Chemicals 公司；anti-phospho-AMPK-a抗体和anti-AMPK-a抗体购自Cell Signaling公司；辣根过氧化物酶标记anti-rabb

13、it及anti-mouse抗体购 自Santa Cruz Biotechnology公司；LumiGL(R)化学发光试剂盒购自New England Biolabs公司；PVDF膜购自Bio-Rad公司。 1.2 新生大鼠心肌细胞原代培养 取新生1-2 d SD大鼠 (北京大学医学部实验动物科学部提供) 心室肌组织, 在含0.1%胰蛋白酶和80 U/ml型胶原酶的Hank抯液中进行消化, 8 min/次, 共8-10次。离心收集细胞, 加入含10% 胎牛血清的DMEM培养液, 接种于100 mm2培养皿中, 在37、5% CO2培养1 h后, 用差速贴壁法除去非心肌细胞, 将未贴壁的心肌细胞接

14、种于6孔板中继续培养。培养液中加入100 mol/L 5-溴脱氧尿嘧啶核苷以抑制非心肌细胞生长。心肌细胞培养48 h，更换为无血清DMEM培养液24 h后加药处理。用免疫细胞化学方法对培养的心肌细胞进行纯度鉴定。 1.3心肌细胞蛋白合成测定 采用Bogoyevitch等5报道的方法测定心肌细胞 3H-leucine掺入量来反映心肌细胞蛋白合成情况。无血清DMEM培养心肌细 胞24 h后, 分别加入100 nmol/L或1 mol/L ISO、 10 mol/L NE或先用AR拮抗剂孵育细胞30 min再加入NE, 培养心肌细胞48 h, 并提前6 h加入37 kBq/ml 3H-leucine

15、。以预冷的10%三氯乙酸于4固定 细胞30 min, 甲醇洗涤2次, 用1 ml裂解液(0.1 mol/L NaOH, 0.1% SDS)裂解细胞30 min, 将细胞裂解液加入到闪烁液中, 用液闪仪(美国Beckman公司)测定其dpm (disintegrations per minute) 值。 1.4 心肌细胞蛋白含量的测定 无血清条件下培养24 h后, 以100 nmol/L或1 mol/L ISO分别刺激心肌细胞48 h, 1 ml 含0.25% (w/v) SDS的1SSC (standard sodium citrate)裂解细胞。BCA蛋白分析方法测定心肌细胞总蛋白含量, 用

16、Hoechest 33257染色法测定心肌细胞DNA含量6 。用总蛋白量/DNA表示心肌细胞蛋白含量, 以排除因细胞数量不同产生的差异。 1. 5 心肌细胞葡萄糖摄取的测定 根据Fischer等7的报道, 以心肌细胞对3H-2DG摄取量来反映其对葡萄糖的摄取情况。 无血清条件下培养24 h后换为低糖DMEM培养液, 以1 mol/L ISO、 10 mol/L NE分别刺激心肌细胞48 h, 或先用AR拮抗剂孵育细胞30 min, 然后加入NE, 在加入药物同时加入37 kBq/ml 3H-2DG继续培养48 h, 20 mol/L细胞松弛素终止反应。0.5 mol/L氢氧化钠裂解细胞15 m

17、in后, 加入同体积0.5 mol/L盐酸中和。用BCA法测定蛋白含量,用液闪仪测定加入闪烁液中细胞裂解液的dpm值。 不加任何激动剂只加入20 mol/L细胞松弛素培养48 h测得的dpm值为心肌细胞非特异性结合的放射活性。 (心肌细胞总放射活性-非特异性结合的放射活性)蛋白含量即得出心肌细胞 3H-2DG摄取量。 1.6 蛋白质免疫印迹检测 心肌细胞总蛋白提取: 无血清培养24 h后, 以1 mol/L ISO、 10 mol/L NE分别刺激心肌细胞48 h, 或先用AR拮抗剂孵育细胞30 min, 然后加入NE。每孔中加入200 ml细胞裂解液裂解细胞10 min, 超声处理后于4,

18、12000 g离心15 min, 取上清备用。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹杂交: 细胞裂解液(25 mg总蛋白量/泳道)经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS)分离蛋白后, 将蛋白转移到PVDF膜上, 于TBST (5% BSA)室温封闭1 h, 分别与一抗(anti-phospho-AMPK-a抗体, 抗体稀释度为1:2000)和二抗(辣根过氧化物酶标记, 稀释度1:4000) 室温先后孵育2 h和1 h, 每次孵育完毕后用 TBST漂洗35 min。将膜与化学发光增强剂室温孵育1 min后用X光胶片曝光显影。此PVDF膜洗脱后再用anti-AMPK- a抗体孵育, 重复上述二抗孵育、

19、漂洗和显影等步骤。对显影条带进行密度扫描定量。以AMPK- a亚基Thr172磷酸化(p-AMPK-a)的程度反映AMPK活性。将p-AMPK- a与AMPK-a的光密度比值表示AMPK-a磷酸化的程度。 1.7 统计学处理 以上实验结果以meanSE表示。数据统计采用Prism 3.0软件进行分析(Graphpad Software Inc.)。对照组与处理组之间的比较采用t检验或方差分析。 P0.05, n=4）;同样条件下持续刺激心肌细胞48 h, 心肌细胞3H-leucine掺入量分别为253.215.1、273.117.5 dpm, 与对照组(257.114.9 dpm)相比无显著差

20、异(P0.05, n=4)(图1A)。 用10 mol/L AR非选择性激动剂 NE持续刺激心肌细胞48 h, 心肌细胞3H-leucine掺入量较对照组明显增加 (664.2106.4 dpm vs 235.916.5 dpm, P0.05, n=4) (图1B)。 图 1. -AR激动对心肌细胞蛋白合成的影响 Fig. 1. Effect of -AR on protein synthesis in neonatal rat cardiomyocytes. After 24 h in serum-free medium, cardiomyocytes were stimulated wit

21、h 100 nmol/L or 1 mol/L ISO for 24 h or 48 h (A), or pretreated with Praz for 30 min, then stimulated with NE (10 mol/L) (B) for 48 h. 3H-leucine was added 6 h before harvest. The relative 3H-leucine incorporation of stimulated myocytes compared with that of unstimulated myocytes is shown as meanSE

22、from four to five independent experiments. *P0.05, n=4)(图2）。 图 2. -AR激动对心肌细胞蛋白含量的影响 Fig. 2. Effect of -AR on protein content in neonatal rat cardiomyocytes . After 24 h in serum-free medium, cardiomyocytes were exposed to 100 nmol/L or 1 mol/L ISO for 48 h. Total protein contents were measured by us

23、e of the BCA protein assay reagent and corrected by DNA contents. Data were normalized by mean of nonstimulated control. Each data represents meanSE from four independent experiments. 2. 3 -AR激动对心肌细胞葡萄糖摄取的影响 1 mol/L ISO持续刺激心肌细胞48 h可使心肌细胞对葡萄糖的摄取量明显增加, 较对照组增加7.12.5倍(554. 6177.5 dpm/mg vs 79.94.9 dpm/m

24、g, P0.001, n=3)(图3A）。用Praz预处理心肌细胞30 min, 再给予10 mol/L NE刺激48 h, 心肌细胞葡萄糖摄取量亦显著高于对照组(530.522.2 dpm/mg vs 84.33.5 dpm/mg, P0.05, n=3)。 图 3. -AR激动对心肌细胞葡萄糖摄取的影响Fig. 3. Effect of -AR on glucose uptake in neonatal rat cardiomyocytes. After 24 h in serum-free medium, cardiomyocytes were stimulated with 1 mol

25、/L ISO (A); or pretreated with Praz or Praz plus Prop for 30 min, then stimulated with 10 mol/L NE (B) in the presence of 37 kBq/ml 3H-2DG for 48 h. Data were normalized by mean of nonstimulated control. Each data represents meanSE from three independent experiments. *P0.001 vs control. 2.4 -AR激动对心肌

26、细胞AMPK磷酸化的影响 1 mol/L ISO刺激心肌细胞48 h使AMPK磷酸化程度较对照组增加6.21.7倍 (P0.05, n=3)(图4A)。用Praz预处理心肌细胞30 min, 再给予NE刺激48 h, 心肌细胞AMPK磷酸化程度亦显著高于对照组4.11.4倍(P0.05, n=3); 而同时用Praz及Prop预处理后, 再给予NE刺激, 心肌细胞AMPK磷酸化程度与对照组相比则无显著差异(图4B)。 图 4. -AR激动对心肌细胞AMPK磷酸化程度的影响Fig. 4. Effect of -AR on AMPK phosphorylation in neonatal rat

27、cardiomyocytes. After 24 h in serum-free medium, cardiomyocytes were stimulated with ISO 1 mol/L (A) or pretreated with Praz or Praz plus Prop for 30 min, then stimulated with NE 10 mol/L for 48 h (B). The upper in each panel shows the representative Western blot. The lower shows the average data fr

28、om three independent experiments. *P0.05, *P0.01 vs control. 3 讨论 当机体处于应激状态时, 交感-儿茶酚胺系统被激活, 血中肾上腺素和去甲肾上腺素浓度增高, 通过AR实现心血管系统功能和代谢状态的调节, 以适应机体应激的需要8。已知-AR激动可介导心脏的正性变 力和正性变时效应2。但是了解-AR长期激动对心 肌细胞能量代谢的影响, 对全面认识-AR在调节心脏功能中的作用具有重要意义。为此, 本实验以培养的新生大鼠心肌细胞为模型, 观察了-AR激动48 h后心肌细胞的蛋白质合成速率、葡萄糖摄取量和AMPK活性的变化, 初步分析了-A

29、R持续激动对新生大鼠心肌细胞代谢的影响及其机制。 实验首先观察了-AR激动对心肌细胞蛋白质合 成速率及蛋白含量的影响。结果显示, -AR特异性激动剂ISO (100 nmol/L或1 mol/L)或先用1-AR特异性拮抗剂Praz预处理心肌细胞30 min后, 再给予10 mol/L NE, 即在仅持续激动-AR 24 h和 48 h的条件下, 心肌细胞3H-leucine掺入量均无显著变化。此外, ISO持续刺激也不能引起心肌细胞蛋白含量增加。可见-AR激动对新生大鼠心肌细胞蛋白合成和蛋白 含量并无明显作用, 说明单独激动-AR不影响培养的新生大鼠心肌细胞蛋白质的代谢。这一实验结果与 Sim

30、pson等人9的报道相同, 他们的研究认为, 新生大鼠心肌细胞的蛋白合成主要是由1-AR介导的, 而-AR并不参与。从我们的结果也可以看出, 当用1-和-AR非选择性激动剂 NE持续刺激心肌细胞时, 心肌细胞3H-leucine掺入量明显增加。当先用1-AR特异性拮抗剂Praz预处理心肌细胞以阻断1-AR, 再给予10 mol/L NE刺激即仅激动-AR的情况下, 心肌细胞3H-leucine掺入量并无明显增加。说明在交感- 儿茶酚胺系统促进新生大鼠心肌细胞蛋白合成过程中a 1-AR的激动是占主导地位的, 而-AR的独立作用不明显。但这一结果并不能否定-AR在心肌肥厚发生 过程中的作用。我们以

31、前的研究也表明, 尽管-AR单独激动时, 对心肌细胞蛋白合成无直接的作用, 但当-AR与1-AR同时激动时, -AR对1-AR引起的心肌细胞蛋白合成有明显的正协同作用(结果待发 表)。目前对1-AR和-AR在心肌肥厚发生过程中 的作用还存在争议。Simpson及Knowlton等9,10 研究发现, NE引起的新生大鼠心肌细胞肥大反应主要由1-AR介导, Gq及MAPK途径激活在其中起重要作用; Pinson等11认为1-AR与-AR共同介导了成年大鼠 心肌细胞肥大反应; 在对整体动物心肌肥厚的研究表明, 长期输注-AR激动剂可导致明显的心肌肥厚和心力衰竭12。我们的实验对象是离体培养的新生大

32、鼠心肌细胞, 与成年大鼠及在体心脏的情况可能有所不同, 这也是本研究的局限性所在。 用1 mol/L ISO持续激动心肌细胞-AR 48 h, 心肌细胞对葡萄糖的摄取量明显增加, AMPK活性明显增高。同样, 用Praz预处理心肌细胞阻断1-AR后,再用10 mol/L NE激动-AR, 心肌细胞葡萄糖摄取量及AMPK活性亦显著高于对照组。正常心肌组织 的代谢速率极其迅速, 60%-90%的ATP由脂肪酸在线粒体中的-氧化所产生, 10%-40%ATP由来自于葡萄糖及乳酸的丙酮酸氧化产生。与正常心肌相似, 肥厚心肌也是以脂肪酸尤其是长链脂肪酸如油酸和软脂酸为主要能量来源。但心肌肥厚过程中, 存

33、在心肌能量和代谢的改变, 表现为对长链脂肪酸的氧化明显减少, 而对外源性葡萄糖的摄取和酵解加快。糖摄取和酵解的加快对脂肪酸氧化的降低有一定的代偿意义13,14。临床研究显示, 通过增加葡萄糖的摄取或刺激葡萄糖的氧化, 或通过抑制脂肪酸的氧化改善心肌能量代谢对肥厚心肌功能的维持有重要意义15,16, 但其确切机制并不清楚。本研究结果发现, -AR持续激动使心肌细胞对葡萄糖的摄取明显增加。已知葡萄糖摄取入 细胞的过程是其被氧化利用的限速步骤, 并且我们采用的实验方法是观察在一定时间内心肌细胞对葡萄糖 摄取量的变化, 因此, -AR持续激动对心肌细胞摄取葡萄糖的量、速度及其利用都可能存在促进作用。

34、提示-AR与心肌肥厚发生发展过程中能量代谢状态的改变有关。 AMPK是一种重要的代谢应激蛋白激酶。它是由 、三个亚基构成的异三聚体, 其中为催化亚基, 和g为调节亚基。心脏中主要表达1、 2及2、1、2 亚型。研究表明, 在细胞能量供求发生改变时, AMPK作为细胞内的能量感受器, 主要通过增加心肌细胞葡萄糖转运体 (glucose transporters , GLUT)的转位来促进葡萄糖的摄取,并通过磷酸化乙酰CoA羧化酶而减少丙二酰CoA的生成, 进一步解除其对肉碱脂酰转移酶的抑制, 使脂肪酸氧化加速17,18。本实验中, -AR持续激动引起心肌细胞对葡萄糖摄取的增加的同时AMPK的活性

35、也明显增强, 提示AMPK可能参与了对心肌细胞葡萄糖代谢的调控。 综上所述, 本工作证实了在培养的新生大鼠心肌细胞-AR激动对蛋白合成及蛋白含量等蛋白代谢的 作用不显著, 首次观察到-AR持续激动时心肌细胞的葡萄糖摄取量及AMPK活性的增加, 提示-AR参与了心肌肥厚发生发展过程中能量代谢状态的改变。 然而-AR激动时对心肌细胞脂肪酸代谢有无作用以及AMPK调节代谢的确切机制还有待进一步研究。 参考文献 1 Koch WJ, Lefkowitz RJ, Rockman HA. Functional consequences of altering myocardial adrenergic r

36、eceptor signaling. Annu Rev Physiol 2000;62:237-260. 2 Dzimiri N. Regulation of -adrenoceptor signaling in cardiac function and disease. Pharmacol Rev 1999;51(3):465-501. 3 Barry WH, Gilbert EM. How do beta-blockers improve ventricular function in patients with congestive heart failure? Circulation

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46、and failing heart: potential for therapeutic interventions. Heart Fail Rev 2002;7(2):115-130. 16 Wallhaus TR, Taylor M, DeGrado TR, Russell DC, Stanko P, Nickles RJ, Stone CK. Myocardial free fatty acid and glucose use after carvedilol treatment in patients with congestive heart failure. Circulation

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48、;42(3):238-256. 七夕，古今诗人惯咏星月与悲情。吾生虽晚，世态炎凉却已看透矣。情也成空，且作“挥手袖底风”罢。是夜，窗外风雨如晦，吾独坐陋室，听一曲尘缘，合成诗韵一首，觉放诸古今，亦独有风韵也。乃书于纸上。毕而卧。凄然入梦。乙酉年七月初七。啸之记。 1号题第一站：病史采集：男，21岁，腹痛伴恶心呕吐8小时急诊就诊。病历分析是十二指肠溃疡。第二站：体格检查是血压测量，颈部部淋巴结检查，肺底移动度，脾触诊，Brudzinski征。基本操作，腹穿。第三站：正常心电图，右侧气胸。2号题病史采集：发热，右颈部包块病例分析：腹股沟斜疝，肠梗阻操作：皮肤弹性及水肿检查，心脏叩诊，腹部体表标志及

49、四分法，吸痰 上机：肝癌，三度房室传导阻滞等3号题第一站：病史采集：呼吸困难 病例分析：子宫肌瘤 节育环4号题病史采集：反复发作喘息，加重；病例分析是：乳腺囊性增生（鉴别诊断：乳腺癌、乳房纤维腺瘤，进一步检查：B超、乳腺钼靶、肿物穿刺活检；治疗原则：戴胸罩、服用逍遥散等中药、胀痛严重时可考虑在月经前10天服用甲基睾丸酮）1、病史采集:患者女，岁，发热，咳嗽，咳痰天入院。 、病案分析：男性患者，车涡伤，右下肢活动完全受限，股骨中段肿大，有骨擦感，神清（大体是这样，好多记不得了） 第二站：测呼吸（边讲边做），听肺部，视腹部（边做边讲），肩甲角体位，胃手术的消毒范围（边做边讲，问这个手术是否要备皮）

50、 后面问（生命体征？）5号题病史采集 咳嗽 咳痰 病例分析 前列腺肥大操作 穿手术衣 腋窝淋巴结的触诊。谁有第三站的 麻烦补充6号题 咯血 水痘7 号题第一站；病史采集是关于一个下肢水肿10天来就诊的病人，既往有冠心病史。病案分析为一个59岁的女患者，大便后肛门有肿物脱出，伴有便血，肿物可手法帮助复位，血常规阴性8号题体检：甲状腺触诊单手肝脏触诊膝反射操作：左前臂外伤10小时后清创缝合病史采集:胸骨疼痛3年，2小时再发。冠心病病例分析：内痣伴出血，脱垂9号题1、病史采集:患者女，岁，发热，咳嗽，咳痰天入院。 、病案分析：男性患者，车涡伤，右下肢活动完全受限，股骨中段肿大，有骨擦感，神清（大体是

51、这样，好多记不得了） 2 u第二站：测呼吸（边讲边做），听肺部，视腹部（边做边讲），肩甲角体位，胃手术的消毒范围（边做边讲，问这个手术是否要备皮）后面问（生命体征？）病史采集：反复发作喘息，加重 ；病例分析是：乳腺囊性增生（鉴别诊断：乳腺癌、乳房纤维腺瘤，进一步检查：B超、乳腺钼靶、肿物穿刺活检；治疗原则：戴胸罩、服用逍遥散等中药、胀痛严重时可考虑在月经前10天服用甲基睾丸酮10号题第一站病史询问题号10号，题目是活动后气短一个月，加重一周。高血压病史10年。病例分析是35号，急性肠梗阻第二站体格检查是68号，题目是肺下界移动度的叩诊，肋脊角肾区扣痛，巴宾氏基征阳性的检查操作时胸外心脏按压第三

52、站肺的呼吸音，心电图有正常心电图，x片一个股骨颈骨折，一个是肠梗阻，CT是脑出血11号题病史 是女性26岁 低热盗汗 腹泻2月病例分析是65岁病人，5年反复左胸前区疼痛，加重8小时,既往发作服用硝酸甘油可缓解今次不能缓解血压高既往多在150-180、90 110之间操作是48和1 内容是颈部浅表淋巴结检查和阑尾炎手术的消毒,体格还有个膀胱12号采集是腹痛，黑便，消瘦病历分析是结核性胸膜炎体格检查胸部视诊问题是胸骨角对的第2肋间脑膜刺激征问题是浮髌实验的意义操作是背部脂肪瘤的切除问题是头颈、四肢扯线时间14号题病史采集：上腹痛，呕吐, ep! U( J# b2 Y& O病例分析：COPD15号题

53、病史采集是腹痛，呕血，黑便。病例分析是过敏性鼻炎和支气管哮喘16号题：采集：上腹痛5年，加重伴呕吐2天。病例分析：胸痛7天，加重4小时。诊断应该是心梗。感觉时间比较紧，后面的进一步检查和治疗都是瞬间写的，肯定丢分不少，亏啊！第三站心肺听诊：奔马律、右下方呼吸音减弱；X线：左肺炎（左胸闷、气喘n天，忘记了）、股骨骨折；CT（饱食后恶心、呕吐2年）：肝癌；心电图：心梗、另一题好像错了，选了左束支传导阻滞；医德医风：A。得了18分17号题号题采集：上腹痛5年，加重伴呕吐2天。18号题病史采集。女17岁，腹痛，腹泻，呕吐。病例分析肺心病，心功能2级，心衰。慢性扁桃体炎（还有关节疼痛，怀疑风心病）体格检

54、查，乳房触诊，直肠指诊，肋脊角扣诊C、脊肋角叩击痛操作（5分）被检查者体位、肋脊点选择正确（2分）?嘱检查者采取坐位或侧卧位（1分），肋脊点选择正确：第十二肋与脊柱夹角的顶点（1分）。?叩击操作正确（3分）。检查者用左手掌平放在被检查者脊肋角处，右手握拳，用由轻到中等的力量叩击左手背（1分），每叩1-2下，停一停，重复2-3次，同时问被检查者感觉（1分），两侧均叩，进行对比（1分）。D、检查结束，爱伤意识。（1分）态度、语言（告知）、动作技能操作救护车，上臂开放性骨折，无进行性出血。三角巾固定考官提问 1胸骨角的临床意义?胸骨角位于胸骨柄、体交界处，两侧与第二肋软骨相连,是临床胸部计算肋骨的标

55、准之一2如果患者腹部发现条形物 考虑哪些疾病19号题，病史采集：肝硬化腹水病例分析：急性乳腺炎操作：穿脱手术服带无菌手套体检：心脏的听诊，膝关节和小腿的检查，问了浮髌试验？3站：考了脑梗！正常心电图，三度房室传导阻滞，20号题：1、笔试：病例分析：乳腺囊性增生2、操作：穿手术衣、乳腺触诊、腹部触诊：反跳痛、紧张度等上机拿了19分，最后一道是抗生素的，错了21号题，体格检查：脾触诊，问题：肿大分几度：轻度肿大（肋下小于2cm），中度肿大（不过脐），重度肿大（过脐或腹中线）、技能操作前臂清创术，问题：为什么先清创后缝合22号题病史采集：腹泻便血病例分析：心肌梗塞操作：腹股沟淋巴结，心脏叩诊，振水音

56、，小腿骨折包扎上机的不肯定23号题：患者女性，30岁，自幼体弱。易感冒，咽痛，经常咳嗽，常呈现劳力性呼吸困难，近日出现夜间阵发性呼吸困难，坐起后稍好转。在外院疑诊为“风湿性心脏病，二尖瓣狭窄”，患者来院诊治。（18分）考试与评分标准：（1）、考官问：你作为接诊医师，体格检查过程中在对本病例心脏视诊方面应特别注意那些内容？ 答：心前区有无隆起（1分）或凹陷（1分），心尖搏动位置与范围是否左移和弥散（1分）。（2）、考官指定考生做心脏视诊，并要求考生正确叙述被检查者心尖搏动的范围（12分）。A、查体前，爱伤意识。（1分）态度、语言（告知）、动作B、被检查者仰卧位（或坐位），正确暴露胸部。（1分）例

57、：仰卧位时，上至颈以下，下至中上腹，两侧至腋中线。（暴露不规范扣分）C、视诊法正确（5分）24号题一、病史采集病例分析1,厌油腻 右上腹痛伴黄疸！2，左颞顶部出血三、上机脑出血 奔马律第2站1、间接法测血压、心脏叩诊 、腹部血管杂音听诊2、上臂开放性骨折的紧急处理及三角巾包扎25号题操作 左前臂外伤10小时后清创缝合26号题：颈椎第7棘突的位置，腹部包块的触诊。简易呼吸器的使用。27号题目一、病史采集病例分析1,进食油腻厚右上腹痛伴黄疸！2，左颞叶出血三、上机脑出血 奔马律28号题操作：皮肤弹性，肺部叩诊，肝脏触诊，皮肤消毒，腹部皮肤消毒病史采集：肝癌病历分析：高血压一级心律失常低钾血30号题

58、病史采集：男性青年上腹胀痛伴呕吐，既往有溃疡病史。病例分析：青年女性多汗心悸体重减轻。FT3 FT4 TSH 升高有突眼，双手震颤，心电图窦性心动过速。甲状腺二度弥漫性肿大。心尖部可闻及2/6吹风样杂音。辅助检查 FT3 FT4 TSH升高体格检查：1、甲状腺二度肿大，口述内容。2、肝脏单手触诊。3、膝反射（正常情况应该下肢抬高）提问：甲状腺肿大分度基本操作：患者左前臂有一深达5cm伤口，请在模拟人操作清创缝合术。注意无菌操作。31号题病史采集：胸部闭合损伤。病例分析：甲状腺癌 技能操作1、腋窝淋巴结的触诊 2、吸氧术 多媒体：1、肠梗阻X线片 2、左侧股骨骨折X线片 3、正常心电图，室速心电

59、图 4、硬膜下血肿CT片32题河南执业病史采集间断咳嗽咳痰痰中带血有吸烟史病例分析风湿胸廓体表标记膀胱检查脑膜刺激征阑尾炎换药心电图正常室速（不确定）食管癌股骨骨折外加脑出血33号题病史：肺结核，。病例：糖尿病/病史采集:咯血并发热/盗汗肺结核/病例分析:？型糖尿病中年男性三多一少症状有家族史尿糖阳性（鉴别诊断：糖尿病、甲状腺功能亢进症；进一步检查：检查血脂、定期监测血糖变化、24小时尿糖定量、眼底检查、肝肾功能检查。治疗原则：一般治疗。生活规律，预防感染、饮食治疗、降血糖药物治疗）体格检查:口述呼吸运动 肝脏单手确诊 浮髌试验/操作:脊椎搬运/第一题心脏听诊:心律不齐第二题肺部听诊:两肺哮鸣

60、音并啰音第三题X光:右侧气胸第四题X光:胫腓骨骨折第五题:CT片.脾破裂第六题心电图:正常第七题心电图:室上性心动过速第八题:医德医风,这题就不说了,要是不会做直接回家34号题 病史采集：咳嗽咯血2个月 胸痛2周病例分析：反复腹痛2个月 十二指肠溃疡 并出血 中度贫血 体格检查：眼睛角膜巩膜检查 胸部叩诊 墨菲事诊阳性诊鉴于什么病 面罩给氧的方法，湿化瓶的作用上机操作：正常心电图、阵发性室上性心动过速、右尺桡骨骨折35号题，急性肠梗阻36 号题：采集：女性，四肢关节疼痛讨论：男性，22岁，腹痛伴呕吐2天查体：胸部体表标志腹部液波震颤操作：吸氧提问：颈椎前屈后伸的最大角度都是多少？吸氧为什么要湿