高通量测序及临床应用

1、2018-5-1412测序技术概述高通量测序及临床Illumina测序原理测序应用及文库类型应用33技术支持：黄亮时间：2018/5/5临床应用测序技术概述12测序技术概述Illumina测序原理测序应用及文库类型临床应用33测序技术概述高通量测序一代、二代及 三代测序技术参数对比测序原理 读长 通量测序技术典型测序平台准确率优点缺点一次对几十万到几百万条 DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术 (next generation sequencing) 足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的 转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(de

2、epsequencing )。12018-5-14Illumina测序原理-概述测序最基本原理Illumina基于可逆终止的，荧光标记dNTP来做边合成，边测序的工作12测序技术概述Illumina测序原理测序应用及文库类型33测序芯片FlowcellLane：八条相对独立通道临床应用两端小孔：进液孔与出液孔Oligo：DNA小片段（2种DNA引物），通过化学键连接在Flowcell上，能与文库两端碱基互补配对Illumina测序原理-基本流程Illumina测序原理-Library PreparationDNA连接酶3端：Klenow 酶Illumina测序原理-Cluster Geneta

3、tionIllumina测序原理-Cluster Genetation变性杂交模板链结合P5变性：双链DNA变为单链DNA，结合方式：碱基互补配对原则杂交在Flowcell上P722018-5-14Illumina测序原理-Cluster GenetationIllumina测序原理-Cluster GenetationIllumina测序原理-Cluster GenetationIllumina测序原理-Cluster Genetation合成复制链（dNTP+聚合酶）模板链洗脱（NaOH）P5P5P5Original template ：与Flowcell 氢键连接，不稳定Newly sy

4、nthesized strand ：与Flowcell 磷酸二酯键连接，稳定P7P7P7Illumina测序原理-Cluster Genetation成桥（中和液）桥式PCR（dNTP+聚合酶）Illumina测序原理-Cluster Genetation变性（NaOH）桥式PCR（中和液）32018-5-14Illumina测序原理-Cluster GenetationIllumina测序原理-Cluster GenetationIllumina测序原理-SequencingIllumina测序原理-Cluster Genetation桥式PCR（dNTP+聚合酶）线性化（NaOH）特定基团

5、特定基团特定基团Illumina测序原理-Cluster Genetation切割阻断ddNTPs 阻断阻止继续扩增Illumina测序原理-SequencingRead1 测序引物杂交（中和液）边合成边测序Cycle 1:按顺序加入反应试剂合成第一个碱基清除未反应的碱基和试剂 激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团Cycle 2-n: 重复前面的步骤42018-5-14Illumina测序原理-SequencingIllumina测序原理-Sequencing测序基于SBS技术PE双端测序SBS（sequencing by synthesis ）：illumina平台采用的是一种

6、基于边合成边测序技术的测序方法，通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。荧光基团切割位点结合碱基，激发荧光检测信号去阻断基团和荧光基团阻断基团荧光基团：不同碱基的识别信号阻断基团：控制碱基合成节奏Illumina测序原理-Data AnalysisIllumina测序原理-Data Analysis图像信号-原始序列数据处理读取反向互补：模板碱基序列-1个循环后+化学试剂：荧光基团+叠氮基团-3 端OH暴露-加入新的dNTP+聚合酶-测序仪扫描-图像分析（图像文件 .tiff文件）Basecalling（光点文件BCL

7、文件）数据传输处理（ BCL2FASTQ）index 拆分出数据接头序列比对 -数据质量分析 -结题报告-高通量测序技术路线12测序技术概述Illumina测序原理测序应用及文库类型临床应用样品准备1DNA/RNA 提取和检测核 酸 打 断3323文库制备和库检上机测序生物信息分析45652018-5-14illumina技术平台型号测序策略laneNovaseq（S2） Novaseq（S4） HiSeqXHiSeq 2500SE50(H)240M12测序技术概述PE50/PE100/ PE150PE150-PE150PE250150M300M600M-SE50(R)150M300M600M

8、90%-1.2T120G960G1.9T80%3.5dIllumina测序原理测序应用及文库类型flowcellrun3.3T1920M3840M90%2.4T6.6T33Q3080%80%周期（1个fc）32h（1.3d）41h（1.7d）3d2d1d临床应用应用基因组、转录组、外显子、 10X微生物、扩增子sRNA、DGE、Chip文库类型介绍建库类型小片段文库（ 180500bp）真核普通转录组 /DGE文库真核/原核链特异性文库350bp微量小片段文库低起始量普通转录组 /DGE/真核链特异性文库原核转录组文库人外显子文库180280bp250300bp人重测序文库350bpDNA文库

9、RNA文库RAD文库200400bp200400bp200500bp350600bp宏转录组文库LncRNA文库small RNA文库circRNA文库RIP文库全基因组DNA甲基化文库ChIP-seq文库10X library1840bpDNA变异检测分析RNA表达分析全基因组测序全外显子测序目标区域测序u转录组测序lncRNA测序miRNA测序circRNA测序代谢质谱250300bpuuu蛋白质谱分析uMeta文库350bpuuPCR产物500bp以上建议打断建库打断建库微生物研究动植物/微生物基因组u单菌测序（denovo/重测）PCR-free文库V4：300bp；V34：470bp

10、；V45：450bp；u扩增子宏基因组扩增子（细菌 16SV4，V34，V45/古菌16SV4/真菌18SV4，V9/真菌ITS1，ITS2）uu转录组测序ITS1：310bp / ITS2 ：380bp遗传病研究高通量测序医学应用1、什么是遗传病？重测序、转录组测序、甲基化及 Chip-seq广泛应用于研究肿瘤学，临床诊断标志物筛选，药物靶点等 (致癌、抑癌基因， ctDNA)癌症遗传病是由于遗传物质的改变，包括染色体畸变以及在染色体水平上看不见的 基因突变而导致的疾病。基于重测序的遗传疾病遗传基础研究；基于多组学的致病机制及基因功能性研究；基于临床检测（如产前检测）的重测序应用遗传病基因突

11、变： 生殖细胞突变所有细胞都存在，可遗传给下一代&体细胞突变基于重测序研究遗传因素与药物反应的关系，提高用药安全性及有效性（药物敏感性、毒副作用、耐药基因）。不会传给子代，可传给由突变细胞分裂所形成的各代子细胞群，在局部形成突变细胞群体，即肿瘤药物基因组产生原因： 遗传因素环境因素菌群的组成、功能与疾病（ 如肠道癌症、糖尿病 、肥胖症、高血压、精神类疾病等等） 之间的关系如何阐述？ （肠道、胃、口腔）病原微生物其他疾病完全或部分由遗传因素决定的疾病，常为先天性的，也可后天发病。基于转录组层面测序，挖掘 生物标志物 ，基因功能性研究，反向验证遗传背景、表观修饰进一步研究疾病发病机制人体有2.5w

12、个蛋白编码基因，分布在 23对不同的染色体上3562018-5-14家系散发样本研究思路染色体病又称染色体综合征，是指遗传物质的改变在染色体水平上可见的疾病，表现为 染色体数目的改变（如单体性、三体性），或 染色体结构的异常（如染色体片段的缺失、重复、重排等）家系样本散发样本01染色体病 常染色体病 eg：21三体综合征（唐氏综合征）性染色体病 eg：先天性睾丸发育不良、先天性性腺发育不良显隐性遗传02 单基因病单个基因的突变导致的 疾病，根据OMIM数据库，目前有6,136表型的分子基础是已知的，有3864个基因被报道与已知疾病 或表型相关。 按照孟德尔法则传至后代，根据突变基因所在位点的和

13、性状分为：a.常染色体显性遗传病； b.常染色体隐性遗传病； c.性连锁遗传病Dominant/Recessiveinheritance常规研究思路Regular methods遗传病分类 03 多基因病 由多个基因及环境因素（包括致病微生物）相互作用所致，且在家系中 不符合孟德尔遗传定律新生突变De novo mutations的疾病。其特点：遗传模式是尚不可知的，由于遗传和环境交互作用，因此找不到一种固定的框架来解释这种疾病的遗传模式；遗传异质性；表型异质性04 线粒体病 每个细胞含有上千个线粒体，每个线粒体又有 2-10个DNA。线粒体DNA只能通过母亲传给孩子，遗传模式未知Regula

14、r methodsCase/Control 关联分析即属于母系遗传。遗传学特征：具有半自主性；母系遗传；阈值效应；有丝分裂和减数分裂期要经过复制分离05 罕见病指那些发病率极低的疾病。又称孤儿病。目前全世界已确认的罕见病有 6930多种，约占人类疾病的10%，中国已确认的罕见病有 5781种。连锁分析/纯合子区域分析Linkage analysisROH analysisFamiliar samplesSporadic samples癌症基因组学分析软件比对软件：变异类型点突变（Single nucleotide variants, SNV）插入/缺失（Insertion/Deletion,

15、InDel ）拷贝数变异（Copy number variants, CNV结构性变异（Structural variants, SV ）Germline变异检测:GATKSomatic变异检测点突变（Single nucleotide variants, SNV ）: MuTect插入/缺失（Insertion/Deletion, InDel）:Strelka拷贝数变异（Copy number variants, CNV ）：Control-FREEC结构性变异（Structural variants, SV ）： Crest变异注释：Annovar图. 一个肿瘤基因组 circos 图展示

16、变异信息（Stratton et al., 2009 ）图. 癌症信息分析流程图提供领先的基因组学解决方案提供领先的基因组学解决方案Providing advanced genomic solutions!Providing advanced genomic solutions!癌症基因组学易感基因Susceptibility gene致病机理Pathogenetic mechanismGermline突变异质性Heterogeneity耐药机制Resistance mechanism研究方向转移复发机制Translocation and recurrence治疗敏感及不敏感两组患者分子分型同

17、一癌种不同亚型患者Molecular subtyping同一患者肿瘤组织及不同时间点 cfDNA同一患者肿瘤组织及多个 CTCSomatic突变每位患者取一例正常样本液体活检CTC/ctDNA研究Study of CTC/CtDNAPDX小鼠模型Patient derived xenograft图. 癌症基因组研究方案设计（ Mwenifumbo and Marra, 2013）提供领先的基因组学解决方案Providing advanced genomic solutions!提供领先的基因组学解决方案Providing advanced genomic solutions!72018-5-14癌症