高效液相色谱法测定杜仲愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸

1、高效液相色谱法测定杜仲愈伤构造和悬浮细胞中绿原酸张志斌，邱晓芳，颜日明，曾庆桂，游海朱笃【摘要】目的创立高效液相色谱法测定杜仲愈伤构造和悬浮细胞中绿原酸含量。要领使用Hypersil18-DS柱(2504.6，5)色谱柱，乙腈-水-磷酸溶液(1287.90.1)为活动相，检测波长为327n，流速1.0l/in，柱温为25。结果绿原酸在2.21655.4g/l范畴内线性干系精良，r=0.9981，愈伤构造和悬浮细胞中绿原酸的均匀加样接纳率别离为100.69%和97.62%，RSD别离为2.42%和2.71%。结论该要领快速轻便，正确可靠。杜仲愈伤构造和悬浮细胞中绿原酸含量别离为1.528g/g和

2、3.949g/g。【关键词】杜仲愈伤构造悬浮细胞绿原酸高效液相色谱法Keyrds：Euiaulidesliv;allus;Suspensinell;hlrgeniaid;HPL杜仲Euiaulidesliv为杜仲科杜仲属植物，为我国珍贵中药材，具有补肝肾、强筋骨、安胎、落血压之成果1。比年来，我国的制药产业、保健品消费以及产业质料等方面临杜仲的需求不竭增长2。人们为了寻求短期经济效益，无筹划人工砍伐开采杜仲资源，加之杜仲生长迟钝，天然情况的粉碎等缘故原由，杜仲野生资源日趋枯竭，已经不克不及满意人们的必要。因此除充实使用现有野生杜仲资源外，使用杜仲愈伤构造和细胞的大范围造就来得到高含量药用身分的

3、质料提供应杜仲产业市场已成为一种生长趋势。绿原酸是杜仲中一种紧张的活性身分，具有抗菌、抗病毒、保肝、落压等药用成果，2022版?中国药典?将其量的凹凸定为评价杜仲药用代价的重要技能指标之一3。使用HPL法测定杜仲绿原酸的研究已有大量报道4，5。为了共同杜仲愈伤构造和细胞造就的研究，本研究创立了测定杜仲愈伤构造和悬浮细胞中绿原酸的HPL要领，并使用HPL法对愈伤构造和由杜仲疏松愈伤构造创立的悬浮细胞系下造就所得的细胞中绿原酸举行了含量测定，从而为使用细胞工程要领消费绿原酸提供必然的实行根据。1质料与仪器Agilent1100高效液相色谱仪(装备四元泵，VD检测器，真空脱气机，柱温箱)，Hphe事

4、情站，KQ-500DB数控超声洗濯器，Sartrius万分之一电子天平，0.45过滤器，冷冻枯燥体系。绿原酸比拟品由中国药品生物成品检定所提供。杜仲愈伤构造按文献6要领举行诱导和继代造就，愈伤构造2周继代1次，继代3次后，将愈伤构造取出，真空冷冻枯燥后供样品制备用。悬浮细胞是按考献7要领挑选所得疏松愈伤构造在本实行室优化所得的液体造就基下，置于摇床中举行悬浮造就所得。造就1周后，将其取出真空冷冻枯燥供样品制备用。样品提取所用甲醇为阐发纯，HPL用乙腈、磷酸为色谱纯，水为三蒸水。2要领2.1色谱条件色谱柱Hypersil18-DS柱(2504.6，5)，活动相为乙腈-水-磷酸溶液(1287.90

5、.1)；检测波长为327n；流速1.0l/in；柱温为25；进样量为10l，接纳面积外标法。3结果3.1绿原酸的色谱阐发在“2.1项色谱条件下，绿原酸尺度品、杜仲愈伤构造及悬浮细胞溶液的色谱阐发见图13。样品中绿原酸峰与其他非被测身分峰可以或许到达基线分散，可按照尺度品洗脱峰所得保存时间确定样品溶液中绿原酸的峰。图1绿原酸尺度品HPL图谱略图2愈伤构造中绿原酸HPL图谱略图3悬浮细胞中绿原酸HPL图谱略3.2尺度曲线的制备取按“2.2项要领制备的储藏液举行尺度曲线的制备。每个比拟品储藏液进样10l，测定峰面积。以峰面积值Y为纵坐标，其对应进样质量浓度(X，g/l)为横坐标，举行回归盘算，得线性

6、方程为：Y=71.904X-40.479，r=0.9981。表白绿原酸浓度为2.21655.4g/l范畴内具有精良的线性干系。3.3细密度实行细密汲取比拟品溶液重复进样5次，每次10l，别离测定峰面积，绿原酸峰面积的RSD(相对尺度缺点)为0.8%。表白仪器细密度和进样要领精良。3.4重复性实行正确称取杜仲愈伤构造和悬浮细胞样品各5份，每份0.2g，按“2.3项下要领制备样品溶液，进样阐发，测定绿原酸峰面积，外标法盘算含量。杜仲愈伤构造和悬浮细胞样品中绿原酸含量的RSD别离为1.8%和2.4%。表白样品处置惩罚要领重复性好。3.5加样接纳率实行正确称取绿原酸含量的愈伤构造和悬浮细胞样品各5份，

7、每份0.2g，别离参加适量绿原酸比拟品，按“2.3项下操纵制备样品溶液，进样10l，测定绿原酸含量，盘算加样接纳率。结果见表1和表2。表1愈伤构造中绿原酸加样接纳实行结果略表2悬浮细胞中绿原酸加样接纳实行结果略3.6样品测定结果按照上述条件对愈伤构造和绿原酸样品举行含量测定，每样品3份。结果见表3。绿原酸的含量在愈伤构造和悬浮细胞中有较大的不同。悬浮细胞中绿原酸的均匀含量为愈伤构造中的2.6倍，说明在悬浮细胞中绿原酸的积聚更有上风。表3杜仲愈伤构造和悬浮细胞绿原酸含量略4讨论4.1提取要领的选择如今提取杜仲中活性身分绿原酸重要包罗超声、回流和冷浸等要领，提取相一样平常为水和有机溶剂8。本文以杜

8、仲愈伤构造为质料对提取要领举行观察，比力了甲醇的含量及提取时间对提取服从的影响。以水、20%甲醇、50%甲醇、80%甲醇为溶剂，超声提取60in，结果以50%甲醇为溶剂时，色谱峰分散结果最正确，并且提取完全；比力l5，30，60，90in的超声提取结果，结果60in时提取服从最高。4.2绿原酸测定要领的创立实行接纳HPL测定杜仲愈伤构造和悬浮细胞中绿原酸的含量，结果正确，细密度高，重复性好，均匀加样接纳率别离为100.69%和97.62%，RSD为2.42%和2.71%。说明该要领可用于杜仲愈伤构造和悬浮细胞范围消费中活性身分的定量阐发。4.3杜仲的愈伤构造和细胞造就由于野生资源的匮乏，通过愈

9、伤构造和细胞造就消费所必要的目的产物愈来愈引起人们的器重与存眷。实行表白泉源于杜仲种子诱导产生的愈伤构造和悬浮细胞都可以或许产生绿原酸，质量分数为1.528g/g和3.949g/g。同野生杜仲叶中报道的绿原酸比拟，愈伤构造和悬浮细胞中含量另有待进步9。我们将进一步通过高产细胞株系的挑选和造就条件的探究与优化，使其到达或超出天然泉源的含量10，11。使用杜仲细胞的大范围悬浮造就消费有关活性代谢产物将具有辽阔的远景。【参考文献】1管淑玉，苏薇薇.杜仲化学身分与药理研究希望J.中药材，2022，26(2):124.2程光丽.杜仲有用身分阐发及药理学研究希望J.中成药，2022，28(5):723.3

10、国度药典委员会.中国药典，部S.北京:化学产业出书社，2022:114.4刘圣金，狄留庆，吴德康，等.高效液相色谱法测定杜仲中绿原酸的含量J.中国中医药信息杂志，2022，13(1):44.5石少澜，王祝举，邵爱娟，等.高效液相色谱法测定杜仲皮中绿原酸的含量J.中国中药杂志，2022，30(9):715.6邱晓芳，朱笃，张志斌，等.杜仲愈伤构造继代造就基按捺褐化的研究J.食品科学，2022，28(8):307.7邱晓芳，朱笃，张志斌，等.杜仲疏松愈伤构造诱导条件的优化挑选J.食品科学，2022，27(11):375.8刘辉琳，唐明林，安莲英，等.杜仲药用有用身分提取要领研究J.天然产物研究与开拓，2002，12(6):47.9尉芹，景谦平，马希汉.杜仲叶中绿原酸的提取工