DB11-T 819-2011-锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范-（高清有效）

1、ICS 11.220B 41备案号：31304-2011DB11B 41北京市地方标准DB11/T 8192011锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范Technical protocol for diagnosis of Koi Herpesvirus Disease20112011080920111201北京市质量技术监督局发 布DB11/T 8192011DB11/T 8192011前言GB/T 1.12009本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市水产技术推广站。本标准主要起草人：王姝、徐立蒲、张振国、王静波、曹欢、贾丽、殷守仁。IIDB11/T

2、 8192011DB11/T 8192011DB11/T 8192011采集的样品不得腐败。4.5 信息采集需采集鲤或锦鲤发病情况、混养其它鱼类发病情况、采样水温等信息。DB11/T 8192011采集的样品不得腐败。4.5 信息采集需采集鲤或锦鲤发病情况、混养其它鱼类发病情况、采样水温等信息。锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范范围PCR定。本标准适用于锦鲤疱疹病毒病的诊断。（）GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范缩略语下列缩略语适用于本文件。下列缩略语适用于本文件。KHV：锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus）KHVD：锦鲤

3、疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease） PCR: 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）Taq酶：Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate）样品要求水温采集样品时的水温应在1632。品种采样品种为锦鲤或鲤。数量按照SC/T 7103执行。状态1KHVD最显著的特征为烂鳃, 鳃出血并产生大量黏液,鳃丝溃烂；体表出现苍白的块斑和水泡；鳍条和尾鳍充血；鳞片上出现血丝；

4、眼球凹陷；口腔和腹部充血和出血。KHVD混养池塘中,只有鲤或锦鲤（且不论大小）生病和死亡,而其它种类，如金鱼、草鱼等无此现象；水温在1830时,特别是在2528时, 鲤或锦鲤大量死亡,当水温升高或降低时,死亡现象下降或停止；死亡极快，一条健康鱼从出现临床症状到死只有24h48h；死亡率极高，疾病发生后在10天内,PCR试剂和材料PCR试剂和材料GB/T 66822008KHVTaq：20dNTP：10 mmoL/L。：25mmoL/L。KHV409bp100pmoL/LKHV-TK-F: 5-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3；KHV-TK-R: 5-CAC-CCA-GTA-GAT

5、-TAT-GC-3。KHVSph292bp100pmoL/LKHV-Sph-R：5-GAC-ACA-TGT-TAC-AAT-GCT-CGC-3。DEPC（DEPC）器材和设备2PCR样品处理体长小于4m4m6cm包括肾6cm取肾、脾、鳃；无临床症状的鱼，另外需加取肠和脑组织。：10（A.1450L1.5mL450LCTAB（A.2），25作用 2 小时。DNA600L（A.3），12000r/min5min， 约700L参见附录12000r/min取上层水相（600L）1.5（900L）离心管于20下，至少后取出。12000r/min30min，11L DEPCPCRDNAKHV-TK100L

6、0.2mL10L2.5L dNTP、10L 0L10倍Taq（A.5、HV-TK-R和 KHV-K-F各L、2.U TaqDEPC100LPCR：945min；951min、501min、721min，40；7210min；4保温。KHV-Sph100L0.2mL10L2LdNTP、L10L10TaqKHV-Sph-RKHV-Sph-F0.5L、2.5UTaqDEPC 100LPCR30s6330s72 30s，40；727min；4设立对照6.3KHV琼脂糖电泳用TBE（A.6），配制1.5%（含1L/mL EB，参见附录A.7）6L样品和2L（5V/cm0.5h3DB11/T 819201

7、1结果判定PCRKHV-TK409bpDNAKHV-Sph，PCR292bpDNAPCR409bp/292bpDNAKHVD。，PCR409bp/292bpDNAKHV的样品可经基因测序确定是 KHV 后，判定为 KHV 阳性。PCR409bp292bpDNAKHV44DB11/T 8192011DB11/T 8192011附 录 A（资料性附录）试剂配制A.1 磷酸盐缓冲液称取氯化钠（NaCl）7.9g，氯化钾（KCl）0.2g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.8g，溶于800mL蒸馏水中，调节溶液酸碱度至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。CTAB溶液按C

8、TAB（hexadecyl trimethy ammonium bromide）2%，氯化钠（NaCl）1.4moL/L（Tris-HCl）20mmoL/L7.5，巯基乙醇至终浓度为0.25%。抽提液1 mmoL/L 三羟基氨基甲烷饱和酚（Tris-饱和酚）、三氯甲烷（CHCl3）、异戊醇（C5H12O）按25：24：1的比例混合，密闭避光保存。抽提液抽提液三氯甲烷（CHCl3）、异戊醇（C5H12O）按24：1的比例混合，密闭避光保存。10Taq按三羟基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl，酸碱度8.8）500mmoL/L，氯化钾（KCl）500mmoL/L，聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）1%配制。TBE（5）称取三羟基氨基甲烷（Tris）54g，硼酸（HBO3）27.5g，乙二胺四乙酸（EDTA）2.9g，加水至1000mL，用稀盐酸（HCl）调节酸碱度到8.0。EB （Ethi