分子生物学DNA的重组与转座市公开课获奖课件

1、第七章DNA重组与转座 DNA recombination and transposition第1页第1页DNA重组概念：DNA 分子内或分子间发生遗传信息重新重叠称为遗传重组或基因重排。 DNA重组意义： 对生物进化起着关键作用。能快速增长群体遗传多样性(diversity)，使有利突变与不利突变分开，通过优化组合积累故意义遗传信息；提供修复机制；调整基因表示等。第2页第2页DNA重组从DNA序列和所需蛋白质因子要求把重组分为4类： 同源重组(homologous recombination) 位点特异(专一)性重组(site-specific recombination) 转座重组(tra

2、nsposition recombination) 异常重组(illegitimate recombination) 第3页第3页7.1 同源重组同源重组(homologous recombination ) 是指两条同源区DNA分子片段间互换过程。第4页第4页1.同源重组分子模型-Holliday重组模型片段重组体拼接重组体第5页第5页第6页第6页7.1.2 异源双链与基因转换第7页第7页7.1.3.细菌基因转移与重组细菌基因转移四种机制 结合(conjugation) 转化(transformation) 转导(transduction) 细胞融合(cell fusion)第8页第8页7.

3、1.4 同源重组酶学机制 细菌接合、转化以及转导重组都是同源重组，并且这种重组是发生在一个完整环状双螺旋DNA分子与一个双链或单链DNA分子片段之间。且重组需要RecA和RecBCD蛋白质。Recombination第9页第9页7.2 位点特异性重组site-specific recombination第10页第10页一、位点特异性重组（ site-specific recombination）1、概念：发生在专一序列而顺序很少相同DNA分子间 重组噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2、特性：在特定结合序列部位，有专一酶催化断裂重接-产生准确DNA重排都含有整合作用两个基本特性a、

4、 典型保守性重组-互换是互相和保留原先DNAb、 发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列专一性核苷酸上第11页第11页7.2.1 phage DNA整合与切除1、实现机制：均是通过-细菌DNA和DNA上特定位点之间重组2、特定位点-附着位点（attachment site att）E.coli attB 以BOB表示，由 23bp phage attP 以 POP表示 240bp 关键序列 “O”完全一致 （同源部分） -位点特异性重组发生地方 B, B, P, P-臂第12页第12页3、整合过程 整合后附着位点为 attL（BOP） attR（POB） 整合位点-attB、attP 切除位点-a

5、ttL、attR 整合过程需要整合酶 （integrase Int）（编码） 和寄主整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用第13页第13页溶源性细菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌体第14页第14页4、整合分子机制 关键序列O全长15bp，富含A-T 发生在O内重组互换位点相距 7bp 整合酶结合位点：attP 240bp、attB 23bp(二者作用不同) attP位点负超螺旋为重组所必须-加强了Int和IHF亲和力 -高剂量蛋白维持单链重组所必需结构 Int结合 -关键序列反向位点（切割位置） -结合在att臂上（臂与关键区靠近）第1

6、5页第15页intIHFXis第16页第16页 整合体及其作用 整合体（intasome）- Int和IHF结合到attP时复合物 整合体捕获attB，阐明- a、attB和attP最初辨认靠Int 辨认两序列能力 b、两序列同源性在链互换时为主要原因第17页第17页Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交第18页第18页鼠伤寒沙门氏菌H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白抗原表示互变，称为鞭毛相转变，这种转变是由H片段倒位决定，此倒位是由于特异重组位点hix发生重组后引起。7.2.2 细菌特异位点重组第19页第1

7、9页沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变 第20页第20页7.3 转座作用7.3.1 转座子概念： 转座子（transposon，Tn):是在基因组中可移动一段DNA序列。基因组内不必借助于同源序列就能 改变本身位置一端DNA序列.转座：转座子由基因组一个位置转移到另一个位置过程叫转座。转座过程有5大特点：第21页第21页第22页第22页第23页第23页C基因-Ds基因-Ac基因： Ac-Ds 控制系统玉米易突变位点由来与行为(1950)，染色体结构和基因表示(1951)Barbara McClintock (芭芭拉麦克林托克)1902-1992 第24页第24页 Barbara McClinto

8、ck (1902-1992), a geneticist who integrated classical genetics with microscopic observations of the behavior of chromosomes, was regarded as a genius, nearly incomprehensible thinker. In 1946, she discovered mobile genetic elements, which she called controlling elements. Thirty-seven years later, sh

9、e won a Noble Prize for this work, becoming the third woman to receive an unshared Nobel in science.第25页第25页7.3.2 转座子分类： 1.插入序列（insertion sequence, IS):简称IS因子IS家族结构：正向重复序列（direct repeats, DR）反向重复序列（inverted repeats，IR）1kb左右编码区，仅编码和转座相关转座酶。对靶位点选择有三种形式：随机选择，热点选择和特异位点选择。 第26页第26页ATGCATACGT9876543211234

10、56789987654321123456789987654321123456789987654321123456789ATGCATACGTATGCATACGT倒置重复区靶序列顺式重复区转座子转座子在靶位置插入前后结构第27页第27页2.复合转座子 (Composite transposons )：含有一个中心序列和位于两侧臂（arm）；除了和本身转座相关基因外，中心序列含有抗药性基因等遗传信息；复合转座子两端臂由IS序列构成。第28页第28页复合型转座子 型：两末端有相同IS序列，或正向，或反向。 型：末端有反向重复序列。如TnA家族第29页第29页tnpAtnpRAmp RTn3 结构示意图

11、IRIRres转录单位 tnp A：编码转座酶(1021aa) tnp R：编码蛋白质(185aa)，2种功效：解离酶、阻遏蛋白Tn A家族:TnA是复制型转座转座子，长约5kb左右 。两端含有末端反向重复序列（而不是IS），长约38bp左右，任一个缺失都会制止转座。中部编码区编码三个基因：转座酶，解离酶和抗性基因， TnA家族都带有抗性标识 。靶位点含有5bp正向重复序列。解离位点（res）是TnA家族特有内部位点。第30页第30页7.3.3 转座过程发生机制转座时发生插入作用普遍特性是受体分子中有一段很短(3l2bp)、被称为靶序列DNA会被复制，使插入转座子位于两个重复靶序列之间。对于一

12、个特定转座子来说，它所复制靶序列长度是同样，如IS1两翼总有9个碱基正确靶序列，而Tn3两端总有5bp靶序列。靶序列复制起源于特定内切酶所造成黏性DNA末端。第31页第31页第32页第32页1 复制型转座 (replicative transposition)：Replicative transposition describes the movement of a transposon by a mechanism in which first it is replicated, and then one copy is transferred to a new site.Replicati

13、ve transposition involves two types of enzymatic activity: 转座酶：transposase解离酶：Resolvase 第33页第33页 2 非复制型转座 (nonreplicative transposition)Nonreplicative transposition allows a transposon to move as a physical entity from a donor to a recipient site. This leaves a break at the donor site, which is leth

14、al unless it can be repaired.第34页第34页1)非复制转座：转座子插入到DNA上新位点，首先交错切开靶DNA，再将转座子连接到靶DNA凸出单链上，最后填补空缺完毕转座。The direct repeats of target DNA flanking a transposon are generated by the introduction of staggered cuts whose protruding ends are linked to the transposon.3、转座中普通过程：第35页第35页2)复制型转座:在转座子和靶位点两端分别交错切割产

15、生切口;转座子和靶位点切口末端交互连接(a-f, g-d),形成一个互换结构(cross structure);以游离3末端作为引物进行复制，产生一个包括两个正向重复转座子拷贝复合物，称为共合体(cointegrate), 这一过程在转座酶作用下进行;第36页第36页转座子两个拷贝在res（site of resolution ）位点发生重组，释放两个复制子。这一过程称为拆分(Resolution)，在解离酶作用下进行。第37页第37页非复制转座断裂和再连接过程：Cross structure中供体与转座子之间未断裂链被切开；转座子与两侧靶链连接。Donor (black); target (

16、green)第38页第38页7.3.4 转座子转座特性 p2047.3.5 转座引起遗传学效应(1)转座引起插入突变 各种IS、Tn都能够引起插入突变。假如插入位于某操纵子前半部分，就也许造成极性突变，造成该操纵子后半部分结构基因表示失活。(2)转座产生新基因 假如转座子上带有抗药性基因，它首先造成靶DNA序列上插入突变，同时也使这个位点产生抗药性。第39页第39页(3)转座产生染色体畸变 当复制性转座发生在宿主DNA原有位点附近时，往往造成转座子两个拷贝之间同源重组，引起DNA缺失或倒位。若同源重组发生在两个正向重复转座区之间，就造成宿主染色体DNA缺失；若重组发生在两个反向重复转座区之间，

17、则引起染色体DNA倒位。第40页第40页（4）转座引起生物进化 由于转座作用，使一些本来在染色体上相距甚远基因组合到一起，构建成一个操纵子或表示单元，也许产生一些具育新生物学功效基因和新蛋白质分子。第41页第41页玉米转座子 1932年，美国玉米遗传学家B.McClintock发觉玉米籽粒色斑不稳定遗传现象，于1952年，第一次提出转座因子概念。7.3.6 真核生物转座因子：第42页第42页玉米控制原件 Ac-Ds系统(activator-dissociation-system)，即激活-解离系统； Spm-dSpm(suppressor-promoter-mutator),即克制-增进-增变系统； Dt(dotted)即斑点系统第43页第43页若玉米带有野生型C基因，则胚乳呈紫色；C基因突变阻断了紫色素合成，那么胚乳呈白色;在胚乳发育过程中，突变发生回复造成斑点产生,回复突变发生在早期发育阶段，紫斑就比较大;McClintock推测本来C突变（无色素）是由一个“可移动控制因子”引起，称解离因子(dissociator，Ds)，它能够插入到C基因中（即转座）。另一个可移动控制因子是激活因子(activator，Ac)，它存在可激活Ds转座，进入C基因或其它基因，也能使Ds从基因中转出，使突变基因产生“回复