凝胶色谱法测定头孢地嗪钠中的高分子杂质

1、凝胶色谱法测定头孢地嗪钠中的高分子杂质董嘉君;林锦生【摘 要】目的 建立头孢地嗪钠中高分子杂质(聚合物)的检查方法.方法 采用分子排 阻色谱进行测定,用葡聚糖凝胶G-10(40 120 pm)为填料，流动相A为0.1 molL- 1的磷酸盐缓冲液(pH7.0),流动相B为纯化水,流速为1.5 mLmin-1,检测波长为 254 nm,按外标法以峰面积计算头抱地嗪钠中聚合物的含量结果对该方法的精密 度、灵敏度、重现性、专属性、耐用性、线性与范围等进行考察,各项指标均良好, 对照品进样量在10 140 mgL-1范围内线性关系良好，回归方程为:Y=4 944.7X+41 760.9, r=0.99

2、7 5.结论 方法快速、简便,专属性高,耐用性强,可用于头 抱地嗪钠聚合物的检查.【期刊名称】西北药学杂志【年(卷),期】2009(024)006【总页数】3页(P446-448) 【关键词】 头抱地嗪钠;凝胶色谱法;高分子杂质【作 者】 董嘉君;林锦生【作者单位】 浙江东盈药业有限公司,浙江,上虞,312369;浙江东盈药业有限公司,浙江,上虞,312369【正文语种】 中 文【中图分类】 R927.2实验研究表明，控制产品中高分子杂质是减少P-内酰胺类抗生素变态反应的重要途径之一1。经过查阅有关文献资料2，发现大多数对头孢类抗生素聚合物的方 法学研究都很简单，大多只做了系统适用性实验、精密

3、度、重现性、检测灵敏度、 线性与范围等，而对专属性、耐用性等没有进行进一步的研究。笔者根据中国药 典2005年版附录对药物中高分子杂质测定法的要求，对我厂生产的头孢地嗪钠 中的高分子聚合物检测方法进行研究，并对其进行系统的方法学验证。1.1仪器聚合物测定仪（上海琦特LC-2005型聚合物杂质测定仪）；色谱工作站（浙 大N2000），色谱柱（葡聚糖凝胶G-10,40 120 pm）为填料；玻璃柱（内径1.5 cm，柱高65 cm）；分析天平（梅特勒AB 135-S）。1.2试药磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为AR ；纯化水为公司自制；头抱地嗪对照品 （批号 130520-200501，中国药品生物制品

4、检定所）；头孢地嗪钠样品（批号 070701，070702，070703，浙江东盈药业有限公司）。2.1色谱条件葡聚糖凝胶G-10（40 120 pm）为填充剂，玻璃柱内径1.5 cm，柱 高度约65 cm。以pH7.0的0.1 molL-1磷酸盐缓冲液0.1molL-1磷酸氢二钠溶 液-0.1 molL-1磷酸二氢钠溶液（61:39）为流动相A,以水为流动相B，流速约 为1.5 mLmin-1,检测波长为254 nm。对照品溶液的制备：取头抱地嗪对照品约25 mg，精密称定，加水溶解并定量稀 释制成每1 mL中约含100 pg的溶液。供试品溶液的制备：取头抱地嗪钠约0.2 g，精密称定，置于

5、10 mL量瓶中，加 水溶解并稀释至刻度，摇匀。测定法：取本品约0.2 g，精密称定，置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻 度，摇匀；立即精密量取200 pL注入液相色谱仪，以流动相A为流动相进行测定， 记录色谱图。另精密量取对照品溶液200 pL注入液相色谱仪，以流动相B为流动 相，同法测定。按外标法以峰面积计算，含头抱地嗪聚合物以头抱地嗪计，不得超过0.3%。2.2系统适用性实验分别以流动相A和B为流动相，取0.1 gL-1蓝色葡聚糖 2000溶液200 pL注入液相色谱仪，理论板数按葡聚糖2 000峰计算，为2 552 和1 735.6 ，符合规定（均应不低于700） ，拖尾因子为1

6、.096和0.733 ，符合规定 （均应小于2.0）。在2种流动相系统中蓝色葡聚糖2 000峰保留时间的比值为 10.373/9.823 = 1.06，符合规定（应在0.931.07之间），对照品溶液主峰和供试 品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2 000峰的保留时间的比值为 9.867/9.823 = 1.00 , 10.707/10.373= 1.03，符合规定（均应在 0.931.07 之间）。 2.3溶液稳定性实验取制备好的供试品溶液，分别于0,3和6 h精密量取200 pL, 注入液相色谱仪，记录色谱图。结果各时间点的聚合物峰面积分别为101942,128 444和178 3

7、06 , RSD为28.5%。说明头抱地嗪钠溶液中的聚合物随放 置时间的延长而增加，变化较大，故溶液是不稳定的，样品应在进样前溶解。2.4精密度实验以B为流动相，精密量取头抱地嗪对照品溶液200 pL,注入液相 色谱仪，记录色谱图，连续取同一溶液进样6次，计算头抱地嗪对照品的峰面积 和 RSD 值。结果峰面积分别为 518 265,518 534,510 836,516 606,510 100 和 503 377，平均峰面积为512 953 , RSD为1.16%。表明头抱地嗪钠聚合物的测 定方法，其精密度符合规定（应5.0%）o2.5检测限、定量限精密称取头抱地嗪对照品约25 mg，采用逐步

8、稀释法，以信 噪比为4:1测定其检测限，以信噪比为8:1测定其定量限。结果检测限为0.347 mgL-1,检出量为69 ng，定量限为0.695 mgL-1,定量量为139 ng。2.6重现性实验取批号070701的样品5份，各约0.2 g，精密称定，分别置于 10 mL量瓶中，临测定前用水稀释至刻度，摇匀，以A为流动相，精密量取溶液 200 pL,注入液相色谱仪，记录色谱图，记录聚合物峰面积，以峰质比（聚合物峰 面积与样品取样量的比值）计算RSD值。结果峰质比为511 168,537 745,503641,524 197和537 526，平均峰质比为522 855 , RSD为2.9%。表明

9、本检测方 法重现性良好。2.7 专属性实验 (1)未破坏样品液：取头孢地嗪钠(070701)2 000 mg ，置于100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为未破坏样品液。强碱破坏样品液：取头抱地嗪钠(070701)2 000 mg，置于100 mL量瓶中，加 入0.1 molL-1氢氧化钠溶液1 mL，室温放置30 min后，加流动相溶解并稀释 至刻度，摇匀，作为碱破坏样品液。强酸破坏样品液：取头抱地嗪钠(070701)2 000 mg，置于100 mL量瓶中，加 入0.1 molL-1盐酸溶液1 mL，室温放置60 min后，加流动相溶解并稀释至刻 度，摇匀，作为酸破坏样品液。

10、(4)高热破坏样品液：取头抱地嗪钠(070701)2 000 mg，置于100 mL量瓶中，然 后于80工烘箱中放置60 min，取出，冷却至室温，加流动相溶解并稀释至刻度， 摇匀，作为高热破坏样品液。强氧化破坏样品液：取头抱地嗪钠(070701)2 000 mg，置于100 mL量瓶中， 加入5%过氧化氢溶液1 mL，室温放置30 min后，加流动相溶解并稀释至刻度， 摇匀，作为强氧化破坏样品液。强光破坏样品液：取头抱地嗪钠(070701)2 000 mg，置于100 mL量瓶中，然 后于4 500 Lx光照条件下放置4 h后，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为 强光破坏样品液。分别取各样

11、品液200 pL进样，记录色谱图，计算聚合物峰和单体峰的分离度。结 果各样品聚合物和单体峰的分离度分别为2.2,2.3,2.5,2.4,2.5和2.5，均大于2.0。 以上实验表明在高温、强酸、强碱、强氧化、强光条件下，聚合物峰与单体峰均能 达到良好的分离，故认为本测定法专属性良好。2.8耐用性实验流动相pH值变化的影响配制两份流动相A,用0.1 molL-1氢氧化钠分别调pH值为7.0和7.4，称取两份样品，分别在这两份流动相条件下进样，结果见表1。结果表明，流动相的pH值在7.0 7.4之间变化对聚合物的检查无影响，说明本测定方法对pH变化的影响具有良好的承受能力。流动相组成的影响流动相A

12、为pH7.0的0.1 molL-1磷酸盐缓冲液0.1molL-1磷酸氢二钠溶液-0.1 molL-1磷酸二氢钠溶液(61:39),将此流动相组成比例分别调整为58:42,61:39和64:36,取样品分别在这3种流动相中进样，结果见表2。结果表明，流动相A的组成比例在58:42-64:36之间变化对聚合物的检查无 影响,说明本测定方法对流动相组成变化的影响具有良好的承受能力。流速的影响 保持所确定的其它色谱条件不变,将流速分别调节为1.4 , 1.5和 1.6 mLmin-1,取对照品溶液和样品溶液分别在这3个流速下进样，结果见表3。 结果表明，流速在1.4 -1.6 mLmin-1之间变化时

13、，对聚合物的检测无影响，说 明本方法对流速的变化具有良好的承受能力。2.9 线性与范围 取头孢地嗪对照品适量,配制成质量浓度为10 , 20 , 40 , 60 , 80, 100和140 mgL-1水溶液；以B为流动相，各取200 pL进样，以头抱地嗪 峰面积对质量浓度拟合，回归方程为：Y=4 944.7X+41 760.9 , r=0.997 5。 2.10样品测定按照本文确定的检测方法对我厂生产的头抱地嗪钠3批样品 070701,070702和070703的聚合物检测结果为0.08%,0.08%和0.09%。 因头抱地嗪钠的水溶液不稳定,其高分子杂质随样品放置时间的延长而增加,无法 用同一溶液进行各实验精密度的统计,故进行方法学研究时采用了峰质比来考察方 法学的各项指标。根据药品质量标准分析方法验证指导原则3,杂质定量检查须 对精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和