基于新型微腔体微波反应器的微波辅助衍生-气相色谱质谱法 快速测定水果中的有机酸

1、基于新型微腔体微波反应器的微波辅助衍生-气相色谱质谱法 快速测定水果中的有机酸有机酸是存在于食品中的一类重要风味物质，是构成食品酸味的主要成分，其种类和含量对食品酸度和风味都有重要影响1-2。食品中有机酸的种类很多，主要来源于原材料和生产发酵过程中,同时由于保存或者风味的需要，会添加山梨酸、苯甲酸、柠檬酸等功能性添加剂，这些功能性添加剂也是食品中有机酸的重要来源之一3-4。因此，检测食品中有机酸的种类及含量，可对食品的风味和品质进行监控，有利于提升产品的质量。目前国内外关于有机酸定性定量的方法主要有离子色谱法5、毛细管电泳法6、液相色谱法7、气相色谱法等8。离子色谱、毛细管电泳、液相色谱法主要

2、用于含量高的多元酸和多羟基酸的分析。其中只有衍生化前处理-GC-MS方法可以实现挥发性和非挥发性有机酸的同时检测。然而，传统的衍生化过程操作繁琐且耗时，因此发展了缩短衍生反应时间的方法如微波辅助衍生9、超声辅助衍生化10和固相载体衍生11等。其中微波衍生法较传统的加热衍生方法能够提高衍生反应效率，明显加快反应速率12-15。AMENDOLA等16运用微波辅助衍生结合气相色谱质谱联用技术测定了人尿中的利尿剂，结果利尿剂衍生从传统加热法的3 h大幅度缩短至10 min，并改善了方法的检出限。LIEBEKE等17运用微波辅助甲氧胺和N-甲基-N-三甲基硅基氟乙酰胺硅烷化衍生法结合气相色谱-质谱联用法

3、对细菌代谢产物进行了代谢组学研究，衍生反应时间由加热法的2 h减少到6 min，且不会丢失衍生代谢组样品的定性或定量信息。但目前已报道的微波衍生反应器18-19多为微波萃取合成反应器或家用微波炉改装的传统谐振腔反应系统，需使用较高的微波功率以保证谐振腔内的微波能量密度，同时由于谐振腔中微波多次反射产生不可预测的多模态，很难对衍生反应的升温过程进行平稳、精准的控制，常因升温速度过高导致样品过热等问题，造成衍生副反应、热敏成分分解、溶液过热蒸发将挥发性衍生产物带出反应器等问题，影响了分析结果的的准确性和精密度。由于传统谐振腔反应系统通常采用开口烧瓶为反应容器，瓶口需设置冷凝装置，整个反应器结构复杂

4、、体积大、操作繁琐，亦制约了其在分析中的应用。聚焦式微波系统20-21，如CEM公司的环形聚集微波反应系统，具有明显的单模态微波辐射特征，改善了微波处理过程样品的升温稳定性和温度分布均匀性，克服了传统谐振腔微波反应器的不足，在合成、萃取及分析样品前处理等领域的应用受到广泛关注22-23。本文针对食品风味成分色谱柱前快速衍生处理的需要，对已有聚焦式微波反应系统进行了改进，提出了一种新型微腔体微波反应器，结合已有的低温微波色谱柱前系统，建立了有机酸的微波辅助衍生-气相色谱质谱法(microwave-assisted derivatization-gas chromatography mass sp

5、ectrometry，MAD-GC-MS)分析方法，并用于水果中琥珀酸和柠檬酸2种有机酸的分析。本文的研究旨在改善传统谐振腔微波反应器在色谱柱前处理中存在的诸多问题，为微波技术在食品分析中的实际应用提供新的技术手段。1 材料与方法1.1 材料与试剂柠檬、猕猴桃、番木瓜，当地农贸市场；琥珀酸、柠檬酸(纯度大于99.5%)、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇(均为色谱纯)、浓硫酸(优级纯)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；实验用水为二次蒸馏水。琥珀酸和柠檬酸标准溶液：均为1.0 mg/mL甲醇溶液，于4 避光保存；H2SO4-CH3OH混合衍生试剂：取80 mL冷冻后的甲醇于200 mL烧杯中，于冰水浴

6、中边搅拌边缓慢加入20%浓硫酸(体积分数)，充分混匀后4 保存。1.2 仪器与设备THERMOF I SHER ISQ气相色谱-质联用仪，赛默飞世尔科技有限公司；GC-2022C气相色谱仪，日本岛津公司；KQ-250DA数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TEST0 865红外热像仪，德国德图公司；轻舟低温微波色谱柱前系统及多模式PC控制软件，功率200 W，同轴输出，内设光纤温度控制模块，直径1 mm荧光光纤温度传感器，云南民族大学研制。1.3 实验方法1.3.1 微腔体微波反应器及系统本文研制的微腔体微波反应器结构如图1-a所示，该反应器由小型反应管、微波辐射器和微型腔体三部分组成。

7、反应管是一圆底钳口高硼玻璃小管(10.0 mL)，配有内设组合式密封垫的铝压盖，组合式密封垫由聚四氟乙烯层、硅胶层和屏蔽微波的铝箔层构成。而微波辐射器为一小型微带微波天线，微型腔体为金属材质，具有与反应管相匹配内径的微波辐射器通过法兰连接盘连接。使用时，取待处理溶液于反应管中，在组合式密封垫中设一小孔，使用压盖钳将组合式密封垫和铝压盖压紧于反应管管口，密封后的反应管置于微型腔体中，将光纤温度传感器穿过密封垫片小孔浸入反应管内的溶液中，使用同轴电缆将其同轴输入接口与微波色谱柱前系统主机的同轴输出接口连接(图1-b)，光纤温度传感器与光纤温度传感接口连接，设置微波功率为30 W，控制温度为85 ,

8、 处理时间为4 min，开启微波系统，对反应管中的样品溶液进行处理，反应完成后取出反应管，放置至冷却。a-微波反应器结构图；b-系统实物图图1 微腔体微波反应器结构图和系统实物图Fig.1 The structure drawing of microcavity microwave reactor and the physical map of system1.3.2 色谱分析条件气相色谱分析条件：色谱柱SH-Rtx-1毛细管柱(30 m0.25 mm，ID 0.25 m)；进样口230 ；FID检测器250 ；分流进样，分流比101；柱流速1.0 mL/min；溶剂延迟3 min；进样量1.

9、0 L；升温程序：初始温度80 ，保持2.0 min，以10 /min的速率升温至170 ，保持2.0 min，再以15 /min的速率升温至200 ；载气(N2)流速0.8 mL/min，空气流速400 mL/min，氢气流速40 mL/min。GC-MS分析条件：TR-1MS色谱柱(30 m0.25 mm，ID 0.25 m)，分析条件同上。MS条件：EI电离源；电子能量70 eV；离子源温度300 ；传输线温度250 ；质量扫描范围35650 amu。1.3.3 样品处理和测定分别移取1.00 mL待处理有机酸分析溶液至2只10 mL反应管中，分别加入2.00 mL分数为20%的H2SO

10、4-CH3OH衍生试剂，摇匀，设置微波功率为30 W，控制温度为85 ，微波处理时间为4 min，待反应完成后，取出反应管放置至冷却，5 000 r/min离心5 min，取上清液1.00 mL于5 mL离心管中，再加入1.00 mL蒸馏水和500 L三氯甲烷，超声萃取5 min，5 000 r/min离心2 min，用带有0.45 m微孔滤膜的进样枪取250 L三氯甲烷层液至进样瓶中，进行气相色谱或GC-MS分析。1.3.4 样品处理和测定取新鲜柠檬、猕猴桃或番木瓜样品洗净，去皮除芯，切成小块，称取1.0 g于10 mL离心管，用手持式电动组织研磨器磨细，加入10 mL甲醇，超声提取10 m

11、in，5 000 r/min离心5 min，取上清液1.0 mL，按照1.3.3衍生后进行分析，记录峰面积，采用外标法计算有机酸的含量。2 结果与分析2.1 微腔体微波反应器及性能研究与传统谐振腔微波反应器采用的设有冷凝装置的开口烧管反应容器不同，本研究所设计的微型化微腔体微波衍生反应器(图1-a)，反应容器采用密封的小型反应管，待处理样品溶液量明显减少(3 mL)。用红外成像法研究了微波处理过程反应管内样品溶液的温度分布及变化，图2-a为30 W小功率微波处理4 min后反应管内的红外成像图。由图2可知,反应管内样品溶液的温度呈现明显的均匀分布状态，这可归因于微腔体微波反应器微波能从底部定向

12、馈入，靠近底部的溶液被迅速加热形成向上的快速热对流即“微波搅拌”作用所致。图2-b是30 W小功率微波处理过程样品溶液时中心部位的升温曲线。由图2-b可知，处理时间从1 min增加至5 min，升温曲线呈现了良好的线性，样品温度从25 匀速上升至90 ，且多次测量结果具有较高的精密度。a-红外热成像图；b-升温曲线图2 微波预处理后样品的红外热成像图及升温曲线Fig.2 The infrared thermal image of sample after microwave pretreatment and the heating curve传统的谐振腔微波反应器由于微波的谐振作用，存在多个相

13、互叠加的多模态微波辐射，通常需要使用较大的微波功率以保证大体积谐振腔内的功率密度，因此极性样品在谐振腔内升温非常迅速，适于快速干燥、灰化、热解或消解等需较高温度的“强”处理过程，但对于需要“低温”(低于液体沸点)的衍生等“弱”处理过程，谐振腔中多模态微波具有不可预测性，升温过程难于进行精准控制，极性液体样品强吸收微波迅速升温导致水分过热蒸发，造成大量挥发性衍生产物被水蒸气带出反应器，或热敏目标物质的热分解，难以保证分析结果的准确性和可靠性。本文设计的微腔体微波反应器，由于腔体体积明显小于传统谐振腔不会产生谐振作用，其导波作用可将微波从底部完全定向馈入样品中，使用小功率微波就能保证样品内的微波密

14、度，具有单模态微波可控性好的的特征。由图2的实验结果可知，采用小功率微波对小量样品进行处理，在保证了微波过程快速高效的同时，实现了处理过程升温的匀速平稳、均匀可控，结合精准的光纤温度传感控温模块，可有效将衍生反应温度控制在所需的温度范围内，弥补了谐振腔微波反应器在色谱柱前衍生处理应用中的不足，对于改善微波衍生色谱方法的准确性、可靠性具有重要意义。2.2 衍生物GC-MS鉴定及气相色谱分析将质量浓度为1.0 mg/mL的琥珀酸和柠檬酸2种有机酸标准混合液置于反应管中，根据1.3.3微波甲酯化衍生操作步骤进行微波衍生，采用全波长扫描模式对2种有机酸混合标准溶液衍生物进行GC-MS分析，衍生物的质谱

15、图如图3所示，图3-a和图3-b分别对应的琥珀酸和柠檬酸的甲酯化衍生产物琥珀酸二甲酯和柠檬酸三甲酯。进一步用气相色谱法对琥珀酸和柠檬酸2种有机酸标准混合液的微波衍生产物进行分析，结果如图4所示。由图4-a可知，气相色谱流出峰中，琥珀酸和柠檬酸衍生产物琥珀酸二甲酯和柠檬酸三甲酯的保留时间分别为5.29 min和11.25 min。在上述基础上，根据1.3.4的操作，对柠檬、猕猴桃和番木瓜3种样品进行微波辅助衍生，衍生产物进行气相色谱分析，结果分别见图4-b、图4-c和图4-d，结果表明，3种样品均在保留时间5.29 min和11.25 min处分别出现了明显的琥珀酸二甲酯和柠檬酸三甲酯峰，表明该

16、方法可适用于新鲜水果中琥珀酸和柠檬酸的测定。2.3 微波辅助衍生条件优化2.3.1 硫酸体积分数及衍生剂用量的选择本文采用H2SO4-CH3OH混合衍生剂对柠檬酸和琥珀酸2种有机酸进行微波衍生化处理，测定色谱峰面积。首先考察了混合衍生剂中硫酸体积分数对有机酸衍生物色谱峰面积的影响，结果如图5所示。由图5可知，随着硫酸体积分数的不断增大，柠檬酸的色谱峰面积先增加后减小，当体积分数为20%时，色谱峰面积达到最高，但当体积分数大于20%时，色谱峰面积随之降低；对于琥珀酸，硫酸体积分数从5%增加至20%，色谱峰面积呈缓慢增长趋势，超过20%则随之下降。由图5可以看出，硫酸体积分数对柠檬酸色谱峰面积的影

17、响明显高于琥珀酸，但硫酸体积分数为20%时，2种有机酸色谱峰面积均达到最大，因此，可选择20%的硫酸体积分数进行后续研究。图6为衍生剂用量对色谱峰面积的影响，当衍生剂用量低于1.0 mL时，2种有机酸衍生物的色谱峰面积均呈增加趋势，且均在衍生剂用量为1.0 mL时达最大，衍生剂用量超过1.0 mL时2种有机酸衍生物的色谱峰面积均呈下降趋势，本文选择1.0 mL进行后续的研究。a-琥珀酸衍生物；b-柠檬酸衍生物图3 琥珀酸衍生物和柠檬酸衍生物的质谱图Fig.3 The mass spectrograms of succinic acid derivatives and citric acid d

18、erivativesa-混合标液；b-柠檬；c-猕猴桃；d-番木瓜；1-琥珀酸二甲酯；2-柠檬酸二甲酯图4 琥珀酸和柠檬酸混合标液、柠檬、猕猴桃和番木瓜中有机酸衍生物的气相色谱图Fig.4 The gas chromatograms of organic acid derivatives in standard solutions, lemon sample, kiwi sample and papaya sample2.3.2 微波衍生功率和时间对衍生效果的影响图7和图8分别为微波功率和微波衍生时间对2种有机酸衍生物色谱峰面积的影响。图7结果表明，随着微波功率从10 W增加到30 W，2种有

19、机酸衍生物色谱峰面积随着微波功率增加而增加，30 W时达到最大，其后开始下降。进一步由图8可知，在30 W微波功率条件下，随着微波衍生时间延长至4 min时，2种有机酸衍生物色谱峰面积均趋于最大，据此本文选择30 W微波功率和4 min衍生处理进行后续实验。图5 硫酸体积分数对衍生物峰面积的影响Fig.5 The effect of volume fraction of H2SO4on peak areas of two derivatives图6 衍生剂用量对衍生物峰面积的影响Fig.6 The effect of amount of derivation agent on peak are

20、as of two derivatives图7 微波功率对衍生物峰面积的影响Fig.7 The effect of microwave powers on peak areas of two derivatives图8 微波衍生时间对衍生物峰面积的影响Fig.8 The effect of microwave derivatization time on peak areas of two derivatives图7中值得注意的是，微波功率对2种有机酸衍生的衍生效率有较大影响，当微波功率分别超过30 W或40 W时，琥珀酸和柠檬酸衍生物色谱峰面积分别开始迅速下降，同时观察到反应管上部外壁出现水

21、珠凝结，这说明微波功率过大可导致样品溶液升温过快产生过热蒸发，管内压力增加影响其密闭性，造成衍生物被水蒸汽带出反应管，导致衍生物损失所致。结合图5和图6的结果，当硫酸体积分数或衍生剂用量分别超过20%或1.0 mL时，色谱峰面积均现呈明显减少趋势，同时也可观察到此时反应管外壁出现水珠凝结，说明样品溶液中硫酸增加到一定浓度，同样可导致样品溶液过热蒸发造成衍生物逸出损失的问题。2.4 本法与其他方法对照取2种有机酸标准混合溶液，在衍生剂用量为1.0 mL、微波功率为30 W、反应时间为4 min最佳衍生条件下，测定了2种有机酸衍生物的气相色谱峰面积。与相同浓度有机酸的超声辅助衍生、常规水浴加热衍生

22、的测定结果进行比较，结果如表1所示。由表1可知本文的微波衍生法测定的2种有机酸衍生物的峰面积最大，明显高于超声辅助衍生和传统加热衍生。表明该方法不仅可以显著加快有机酸的甲酯化衍生反应速率，提高前处理的效率，且衍生效果明显优于常规衍生方法，可提高分析的灵敏度，有效改善方法的准确性和精密度。本文设计的微腔体微波反应器能够显著改善衍生反应速率、提高衍生效率的结果与已有谐振腔微波反应器微波衍生的研究相符12-15。表1 不同衍生方式的峰面积测定结果比较Table 1 The peak areas of three different derivatization methods2.5 方法性能指标2.

23、5.1 线性关系采用本文的微波衍生方法，在优化条件下测定两种有机酸的混合标准溶液，以目标物质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到各目标物线性关系，以R2 0.99为判断指标，确定各目标物的线性范围，具体参数见表2。由表2可知，在质量浓度为0.105.0 mg/mL时，2种目标物的R2均达到0.999以上，表明2种有机酸浓度与峰面积具有良好的线性关系，能够满足分析要求。表2 线性回归方程及检出限Table 2 The equation of linear regression and detection limits2.5.2 加标回收和精密度实验分别取柠檬、猕猴桃和番木瓜样品，按照1.3.4方法处理后测定其含量，并如表3所示进行加标回收试验。结果表明，柠檬，猕猴桃和番木瓜不同加标量下，2种有机酸的回收率为98.34%102.52%，相对标准差(relative standard deviation，RSD)为1.63%3.25%(n=6)，