羊胎素对体外骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞分化的影响

1、羊胎素对体外骨髓基质细胞的增殖和向成骨细胞分化的影响【关键词】羊胎素；,骨髓基质细胞；,成骨细胞；,增殖；,分化摘要：目的讨论羊胎素对体外培养的SD大鼠骨髓基质细胞(arrStraells,Ss)的影响。方法用TT法检测Ss的增殖；PNPP偶氮法检测Ss碱性磷酸酶ALP的活性；细胞ALP染色观察成骨细胞的形成。结果在含羊胎素原液的0.625%，1.25%，2.5%和5%时对体外培养的SD大鼠Ss有明显的促进增殖的作用P0.01;在含羊胎素原液的2.5%及5%+成骨诱导剂时，ALP的活性明显高于诱导剂对照组P0.05，而在含羊胎素原液的2.5%和5%浓度组，ALP的活性明显高于空白对照组及诱导剂

2、对照组P0.001；细胞ALP染色呈强阳性，加药组颜色明显深于对照组和诱导剂对照组。结论羊胎素对体外培养的SD大鼠Ss的增殖和向成骨细胞分化具有明显的促进作用。关键词：羊胎素；骨髓基质细胞；成骨细胞；增殖；分化Abstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetsfplaentin,thesubstaneextratfrlabplaenta,nSDratsarrstraells(Ss)prliferatinandstegenidifferentiatininvitr.ethdsPrliferatinfSsediatedbylabplaentinaseasuredbyTTass

3、ay.Thealkalinephsphatase(ALP)ativityfSsasdetetedbyPNPPassay.eanhile,theellsstegenidifferentiatinasexainedbyALPstaining.ResultsThegrthfSsasbviuslyaeleratedbythelabplaentinatthenentratinf0.625%,1.25%,2.5%,5%(P0.01);theativityfALPfSsatthegrupsf2.5%and5%plaentinntainingsteblastinduerassignifiantlyhigher

4、thanthatftheblankgrup(P0.05).Hever,theativityfALPatthegrupsf2.5%and5%labPlaentinithutsteblastinduerassignifiantlyhigherthantheblankgrupandsteblastinduerntrlgrup(P0.001).TheALPstainingellsatallplaentingrupsexhibitedstrngpsitiveresults.Thelrsftheellsatthsegrupseredeeperthantheinduerntrlgrup.nlusinThel

5、abplaentinanrearkablyinreasetheprliferatinandinduethestegenidifferentiatinfSs.Keyrds：Labplaentin;arrstraells;steblasts;Prliferatin;Differentiatin羊胎素是利用现代生物技术从羊胎中提取的一种纯天然的生物活性物质，含有丰富的蛋白质，具有明显的抗辐射、抗衰老、抗肿瘤及进步人体免疫才能的作用13。本实验利用蛋白酶水解提取之羊胎素作用于体外培养的SD大鼠Ss，观察羊胎素对Ss增殖及向成骨细胞分化的影响，为羊胎素作为预防和治疗骨质疏松症提供根据。1器材1.1试剂与

6、仪器DEH、L糖培养基，Gib公司产品；胎牛血清，杭州四季清公司产品；胰蛋白酶、噻唑蓝、对硝基苯磷酸二钠、维生素、地塞米松和-甘油磷酸钠均为Siga公司产品；Perll液，Aershapharaia公司产品；DS，江苏如皋富康试剂厂产品；其它试剂为广州化学试剂厂产品；2培养箱美国NAP；酶标仪美国ELX800；离心机上海安亭仪器厂。1.2药物羊胎素即羊胎水解液由本院医药科技开发中心提供，取来自内蒙的安康羊胎，用现代工艺低温冷冻枯燥制成。实验时取羊胎粉300g，在10倍量水中用蛋白酶水解8h，除去杂质，灭菌，得澄清透明的羊胎水解液总氮含量N=0.69%,pH值6.5；实验时以原液为100%含量，

7、用三蒸水稀释，实验终浓度为含原液的0.625%，1.25%，2.5%，5%和10%5个浓度组。1.3动物1月龄SD大鼠，雌雄各半。由本院动物中心提供(实验动物合格证：粤监证字2022A023号；发证机关：广东省实验动物监测所。动物实验环境设施监测合格证：粤监证字2022055号；发证机关：广东省实验动物监测所)。2方法2.1细胞培养参照文献4，用Perll液进展密度梯度离心的方法和传代贴壁挑选的方法相结合，别离培养大鼠Ss。脱颈处死SD大鼠，用75%酒精浸泡5in，在无菌条件下别离大鼠两侧股骨，去除软组织，切除股骨两端，每根股骨用5lDE(L)培养液从股骨上端往下冲出骨髓，将每根冲出的骨髓搜集

8、于同一烧杯中，充分吹散细胞，900r/in离心10in，弃上清液。沉淀用DE(L)培养液3l制成细胞悬液，将细胞悬液加到等体积的密度为1.073g/l的Perll别离液上，900r/in离心30in后，搜集界面层细胞，用DE(L)培养液洗涤离心2次，最后用含10%胎牛血清DEL培养液含100U/l青霉素100g/l链霉素重悬，吹打均匀后以4105/2密度接种到252培养瓶中，置37，5%2饱和湿度培养箱培养。7d后首次换液，去除悬浮细胞，以后每3天换液1次，细胞交融后用0.25%胰蛋白酶消化，传代。本实验用传至34代的Ss进展实验。转贴于论文联盟.ll.2.2Ss增殖率测定0.25%胰蛋白酶消

9、化已交融成片的基质细胞，并吹打成单细胞悬液，以5104个/l接种于96孔塑料培养板，100l/孔，24h后将培养液换成含5%胎牛血清的DEL培养基90l/孔，同时参加各浓度的羊胎素10l/孔，使其终浓度为0.625%，1.25%，2.5%，5%和10%，对照组参加等量的三蒸水，在加药后的第5d参加TT用PBS溶解，5g/l20l，37孵育4h，将培养液吸出，参加150lDS，待结晶完全溶解后，酶标仪测A值，检测波长为570n，参考波长630n。2.3ALP活性测定0.25%胰蛋白酶消化已交融成片的基质细胞，并吹打成单细胞悬液，以5104个/l接种于96孔塑料培养板，100l/孔，24h以后换液

10、。设空白对照组：10%胎牛血清DEH培养液90l/孔+三蒸水10l/孔；成骨诱导剂10%胎牛血清DEH培养液含10-8l/L地塞米松+50g/l维生素+10-8l/L-磷酸甘油对照组：诱导剂90l/孔+三蒸水10l/孔；羊胎素各浓度组：10%胎牛血清DEH培养液90l/孔+羊胎素10l/孔；诱导剂+羊胎素各浓度组：诱导剂90l/孔+羊胎素10l/孔，每组设8个平行孔，羊胎素的终浓度为含原液的0.625%，1.25%，2.5%，5%和10%。置37，5%2培养箱培养5d，然后，将培养液吸出，用PBS200l/孔洗2遍，参加PNPP孵育液25nl/L二乙醇胺7.5l，1nl/L氯化镁0.75l，6

11、.7nl/LPNPP5l，三蒸水1.75l150l，置37恒温箱避光孵育30in，立即用酶标仪于405n波长测A值。2.4ALP染色采用改进ri钙钴法2来显示ALP。细胞以2104/2接种于6孔塑料培养板，每孔2l，24h后换液，设空白对照组、诱导剂对照组、5%羊胎素+诱导剂组、5%羊胎素组，每组设三个平行孔。每3天换液1次，至14d，染色，拍照。2.5统计学处理用SPSS13.0软件对实验数据进展分析。实验结果以均差s表示。组间比拟采用方差检验。3结果3.1羊胎素对Ss增殖的影响羊胎素作用Ss5d后，0.625%5%的浓度可显著进步细胞的增殖率。与空白对照组比拟P0.01。结果见表1。表1S

12、s增殖率A值测定结果略与对照组比拟，*P0.01，n=83.2对SsALP活性的影响2.5%和5%的羊胎素+诱导剂作用Ss5d后，ALP活性高于诱导剂对照组P0.05；2.5%和5%的羊胎素直接作用Ss5d后，ALP活性显著高于空白对照组P0.001，亦显著高于诱导剂对照组P0.001。结果见表2。3.3细胞ALP染色从照片(图1)中可以看出，5%羊胎素组4，5，6和5%羊胎素+诱导剂组7，8，9经ALP染色后颜色明显深于空白对照组1，2，3和诱导剂对照组10，11，12。而ALP的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。因此，羊胎素能促进Ss向成骨细胞分化。表2作用5dALP活性测定结果略与空白对

13、照组比拟,*P0.001;与诱导剂对照组比拟,P0.05,P0.001；n=8图1羊胎素对Ss向成骨细胞分化的影响略4讨论随着人类寿命的延长，社会的老龄化，骨质疏松症的发病率越来越高，严重影响了老年人的生活质量。因此，骨质疏松症的防治已成为全世界关注的课题。由于以往防治的药物有较多的副作用，长期应用病人不易耐受，所以寻找理想的防治骨质疏松症的药物一直是药理学研究的热点。近年来随着对干细胞研究的深化，对骨质疏松症的发病机制有了进一步的认识，认为Ss中存在的间充质细胞的多向分化潜能与骨质疏松症的发生亲密相关。Ss是具有自我更新、复制及多向分化潜能的干细胞，不但是成骨细胞的来源，还在骨质疏松症发生时

14、骨量减少中起重要的作用。Ss成骨性分化才能下降是发生骨质疏松症的重要原因5。为此，设法保持甚至进步Ss成骨性分化才能被视为一条有效的防治途径。所以目前以Ss作为治疗靶点成为骨质疏松症防治的一个新方向。因此我们通过观察羊胎素能否促进Ss向成骨细胞分化，从而判断其能否通过调节干细胞的分化方向来治疗骨质疏松，为骨质疏松的防治提供新的思路。羊胎素是利用现代生物技术从羊胎中提取的一种纯天然的生物活性物质，含有丰富的蛋白质，具有明显的抗辐射、抗衰老、抗肿瘤及进步人体免疫才能的作用1，3；同时亦具有明显的促进成骨细胞增值、分化和钙化的作用6。本实验利用蛋白酶水解提取的羊胎素作用于体外培养的SD大鼠Ss，在含

15、原液的0.625%，1.25%，2.5%和5%时对体外培养的SD大鼠Ss有明显的促进增殖的作用;在含羊胎素原液的2.5及5%+成骨诱导剂时，ALP的活性明显高于诱导剂对照组P0.05，见表2，在只含羊胎素原液的2.5%和5%时，ALP的活性亦明显高于空白对照组和诱导剂对照组；5%羊胎素和5%羊胎素+成骨诱导剂作用Ss14d后，ALP染色呈强阳性，加药组颜色明显深于空白对照组和成骨诱导剂对照组。从实验中可以看出羊胎素既能促进Ss的增殖，又能促进Ss向成骨细胞分化，因为羊胎素显著进步SsALP的表达，而ALP的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。从实验中还可看出羊胎素促进Ss的增殖和向成骨细胞分化的

16、作用并不随浓度的增加而加强，而是在一定的范围0.625%5%作用最强，因此推测其作用可能是通过受体作用机制发挥，羊胎素对Ss的这种作用机理有待进一步研究。本实验通过体外细胞培养的方法，初步证实了羊胎素具有促进Ss的增殖和向成骨细胞分化的作用。羊胎素的这种既能促进Ss的增殖和向成骨细胞分化，又能促进成骨细胞增殖、分化和钙化的作用，且未见有毒、副作用的报道，在防治骨质疏松方面，应该具有较好的开发前景。参考文献：1杨秀芳，许牡丹，吴明鑫.活化羊胎素的提取与应用开发J.宝鸡文理学院学报自然科学版，1999，19(1):40.2鄂征.组织细胞培养.北京：人民卫生出版社，1981:42.3刘少娟，陈冠敏，何聆.羊胎素延缓衰老作用的研究J.环境与职业医学，2002，19(3):