烟碱去甲基化酶基因的敲除与烟草低害素材创制

1、烟碱去甲基化酶基因的敲除与烟草低害素材创制烟草是管状花目茄科的一种重要的经济作物。与其他植物相比, 烟草具有较高的生物碱含量。通常情况下 , 烟草中含量最高的生物碱是烟碱(Nicotine)。烟碱可以使人的神经系统兴奋 , 具有提神醒脑镇静的作用, 同时它也是栽培烟草的重要品质要素。烟碱在烟碱去甲基化酶 (Nicotine demethylase,NND)的催化下可以生成降烟碱 (Nornicotine),降烟碱是烟草中的毒性成分, 能够使实验动物致癌 , 同时也可对人体健康产生直接的负面影响。烟草的生物碱组成中, 降烟碱含量占烟碱与降烟碱总和的百分比称为烟碱转化率。栽培烟草的烟碱转化率种内差

2、异相对比较稳定, 而种间差异很大 , 这种差异主要是由遗传基因不同而引起的。 栽培烟草中编码烟碱去甲基化酶的基因主要有CYP82E4、CYP82E5v2和 CYP82E10。本文以栽培烟草白肋烟TN90、红花大金元及K326为实验材料 , 通过CRISPR/Cas9技术敲除烟碱去甲基化酶基因, 以期获得低烟碱转化率的烟草低害素材。本文的主要研究结果如下:(1) 在栽培烟草白肋烟TN90、红花大金元及 K326基因组中分别克隆了烟碱去甲基化酶基因CYP82E4、CYP82E5v2和 CYP82E10的外显子 1, 并对其进行生物信息学分析。测序及分析结果显示三种栽培烟草的烟碱去甲基化酶基因外显子

3、1 序列均为 939bp, 且不同烟草栽培品种的同一烟碱去甲基化酶基因序列完全一致。生物信息学分析结果表明三个基因的外显子1 均含有细胞色素 P450 酶高度保守区域以及底物识别结合相关区域。在烟碱去甲基化酶基因外显子 1 上设计敲除靶位点。每个基因分别设计4 个靶位点 , 三个基因共同的靶位点2 个, 共计 14 个敲除靶位点。根据靶位点设计引物 , 分别构建了烟碱去甲基化酶基因CYP82E4、CYP82E5v2和 CYP82E10敲除载体及三个基因共同的敲除载体。通过农杆菌转化法将敲除载体分别转化栽培烟草白肋烟 TN90、红花大金元及 K326,通过抗性筛选获得 T0 代阳性转基因苗 ,

4、并套袋自交收种子 , 播种到卡那抗性 MS培养基上筛选获得 T1代阳性转基因苗。通过检测 T0 代或 T1 代阳性转基因苗烟碱去甲基化酶基因敲除靶位点序列,筛选得到敲除植株。其中白肋烟 T1 代获得纯合敲除植株CYP82E42 株、CYP82E5v26 株及 CYP82E10 5株; 红花大金元 T0 代敲除植株 CYP82E4 5株、 CYP82E5v2 2株、 CYP82E10 1株, 以及 CYP82E4和 CYP82E10双敲植株 1 株 ;K326 T0 代敲除植株 CYP82E4 3株、 CYP82E5v2 4株及 CYP82E10 1株。另外 , 白肋烟 T1 代 CYP82E4

5、基因纯合敲除植株自交获得T2 代纯合敲除植株6 株。(3) 对移栽后 62 天的白肋烟 T1/T2 代纯合敲除植株及野生型对照进行农艺性状测定 , 结果表明 : 敲除株系与野生型白肋烟成熟期生长状况基本一致, 烟碱去甲基化酶基因的敲除对烟草生长没有负面影响, 甚至 cyp82e4 的茎围、叶面积以及 cyp82e5v2 的叶面积显著高于野生型对照。用 0.2%乙烯利处理白肋烟 T1 代敲除植株及野生型植株成熟期离体叶片 , 使其变黄 , 模拟烟草叶片的衰老过程。利用 GC-MS方法测定处理过的叶片的主要生物碱含量 , 并计算烟碱转化率。结果表明 , 白肋烟 TN90野生型对照的烟碱转化率为 5.28%,cyp82e4 、cyp82e5v2 和 cyp82e10