PCR在转基因中的应用

1、PCR技术在转基因食品中的应用（石河子大学食品学院 农产品加工及贮藏专业，李珍新疆石河子832000）摘要：转基因食品近年来，已经成为公众争论的焦点。本文概述了转基因食品国内外发展现 状及在转基因食品安全性基础上，提出了其检测方法P3R技术，并重点介绍了 PCR技术在 转基因食品检测上的应用及发展趋势。 关键词：PCR；转基因食品；食品检测PCR Technology In Genetically Modified FoodAbstract:Genetically modified foods in recent years has become the focus of public deb

2、ate.This article summarizes the current situation and the development of the genetically modified foods in domestic and foreign on the basis of safety,Introduce the detection method-PCR technology, And focus on the application of PCR technology and development trends in the detection of genetically

3、modified foods.Key words:PCR; Genetically Modified Food;Food Testing随着我国食品科学技术的发展及现实的需要，食品检测和分析也在不断进步，特别是面对 迅猛发展的转基因食品，安全问题逐渐被人们所重视，转基因食品是否安全，转基因食品标 识制度能否被严格执行，关键在于是否有准确，可靠的检测技术作保障。PCR技术是1985 年诞生的一项DNA体外扩增技术，该技术自问世以来就备受食品科学领域的青睐，在食品转 基因成分检测方面具有很大的潜在价值。PCR技术又称基因扩增技术，是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction

4、）的缩写， 该技术在转基因食品检测的应用过程中表现出灵敏度高、速度快、特异性强、简便、高效等 特点，是转基因食品检测的重要手段之一 1。1 PCR技术基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由 变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成。模板DNA的变性：模板DNA经加热至93C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩 增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 C左右，引 物与模板DNA单链的互补序列配对结合。引物的延伸：DNA模板一引物结合

5、物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留 复制链重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”而且这种新 链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因 扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。2转基因食品国内外的发展现状转基因食品始于20世纪70年代初，美国开展转基因食品方面的研究最早,但是美国国内 的转基因食品的消费是禁止的。就种植面积而言，转基因作物排序为大豆、玉米、棉花、油 菜、马铃薯。我国的转基因食品的研究和开发居世界

6、中等水平，在大田试验和商品化方面 仅次于美国和加拿大。1999年3月，中国水稻研究所研制的属世界首创的“转基因杂交稻” 研究成果通过专家鉴定,9月华中农业大学的一项转基因水稻通过鉴定，并且达到国际先进 水平。转基因动物研究方面，我国在鱼/兔、鸡、羊等方面取得了突破性的进展。目前，转 基因动物商品化未见报道4。转基因动物的安全评价方案国内外已经有了研究报道。相对美国对转基因的态度，欧盟对转基因食品的态度相对保守。欧盟允许种植的转基因 作物只有大豆、玉米和油菜等，种植面积仅占世界转基因作物面积的0.3%最近，欧盟又根 据高质量的科学评价，对转基因食品进行了更加严格的管制措施，以便更好的保障人类健康

7、 以及环境的安全。我国目前对转基因的态度是科研支持，转基因食品的消费也没有限制， 只是要求生产者如果采用了转基因原料在食品包装上必须标明。至于选择与否，由消费者自 己决定。3转基因食品的安全问题面对越来越多的转基因食品，人们的认识并非一致，以美国为首的主吃派和欧洲为首的 反对派在全球范围内形成了两大阵营。不久前调查表明，美国、加拿大两国的消费者大多已 接受了转基因食品，仅有27%的消费者认为食用转基因食品可能会对健康造成危害。而在欧 洲，大多数人是反对转基因食品的，英国尤为明显。缘由是1998年英国的一位教授的研究 表明，幼鼠食用转基因的土豆后，会使内脏和免疫系统受损，这是对转基因食品提出的最

8、早 质疑，并在英国及全世界引发了关于转基因食品安全性的大讨论。虽然英国皇家学会于1999 年5月发表声明：此项研究“充满漏洞”，得出转基因土豆有害生物健康的结论完全不足为 凭。但是，转基因食品的安全性问题已引起了消费者的怀疑。79%的英国人反对试种基因改 良作物，抵制转基因食品进入市场。转基因食品到底吃还是不吃，一些专家已表明了转基因生物和常规育成的品种是一样的， 两者都是在原有的基础上对某些性状进行修饰，或增加新性状，或消除原有不利性状。常规 育成的品种仅限于种内或近缘种间，而转基因植物中的外源基因可来自植物、动物、微生物。 虽然，目前的科学水平还不能完全精确地预测一个外源基因在新的遗传背景

9、中会产生什么样 的相互作用，但从理论上讲，转基因食品是安全的。4 PCR技术对转基因食品的检测目前，对转基因食品的检测主要是检测是否有外源基因或DNA7,检测是否有外源蛋白质， PCR技术主要针对转基因食品中是否有外源基因或DNA，外源基因中目的基因是转基因食品 开发中研究的重点，随着转基因食品种类的不同，所使用的目的基因也不同，因此通过检测 外源基因中目的基因来鉴别转基因食品，难度较大。而即使在含有不同目的基因的转基因食 品中往往使用相同或相似启动子、终止子或标记基因，这些启动子、终止子和标记基因DNA 序列具有特异性，且大多来自微生物，非植物本身固有，因此通过检测样品是否含有特定启 动子、

10、终止子或标记基因序列作为鉴别转基因食品依据是一种可行方法肌4.1 PCR技术在转基因食品检测中应用刘光明等根据转基因农作物中常用花椰菜叶病毒启动子(CaMV 35s)和根癌农杆菌终止 子(N0S)序列，设计并合成两对不同引物和相对应两种荧光双链探针(FDCP)，分别建立常规 PCR、应用FDCP新型实时荧光PCR检测转基因成分35S启动子和NOS终止子方法。试验结果 表明，两种PCR方法均能有效检测出35S和NOS片段，其中常规PCR方法具有灵敏度高、特 异性好之特点；应用FDCP新型实时荧光PCR方法则更为简便、快速、准确。曹际娟等10， 应用PCR技术对转基因(GM)玉米及其粗加工食品如：

11、爆玉米花、热玉米棒、速溶玉米片中通 常转入基因构建元件35S启动子、NOS终止子和外源抗虫GrvLA(b)目的基因进行检测，对 GM玉米检测低限可达到0.1%。刘垣等in在研究转基因大豆DNA检测芯片时，在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件 进行优化同时，比较芯片检测特异性和重复性，并对检测灵敏度进行测试。结果表明，该方 法具有较好特异性和重复性，检测灵敏度可达0.5%，由于采用多重PCR技术，一次可同时 检测多个基因，提高检测准确性和效率。栾凤侠等12针对该实验材料转入外源基因选择标准中通用外源基因CaMV35S, NOS，bar 和植物内源基因tRNALeu作为特异性引物，对影响定性PC

12、R检测(反应体系：氯化镁浓度， 引物和模板浓度；反应条件：退火温度和时间，循环数等)主要备件进行实验优化和选择， 同时对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明，可检测到CaMV35S, NOS, bar外源基 因预期大小的目的条带，表明定性PCR检测所优化条件适合转基因小麦。实验还测定定性 PCR最低检测灵敏度为1%；同时对转入外源目的基因进行表达蛋白检测，蛋白电泳结果表 明，检测出1Dx5亚基和1Dvl0亚基。国内已有文献报道，在借鉴几种传统定量PCR方法基础上，建立一种新的实时荧光定量 PCR法对转基因产品进行检测。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧 光基因，利用

13、荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后，通过标准曲线对未知模板进行定 量方法。该法有效解决传统定量方法所存在假阳性及准确度不高难题。陈颖等采用实时荧光 定量PCR技术，通过使用特异引物和探针，对玉米中内源基因Invertase和转基因玉米 Mon810、Event176中的外源基因进行定量检测，建立商业化转基因玉米Mon8 1 0(YieldGard) 和Event 1 76(Maximizer)定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度小于0. 01%，是国际上 设定转基因最低限量100倍13。4.2 PCR技术检测转基因食品发展趋势随着各种转基因植物迅速发展，由此衍生而来转基因食品数量也迅速增

14、加，并引起社会 各界对转基因食品争论，转基因食品安全不仅是科学领域问题，也是经济、政治等领域关心 问题，同时也关乎到每一个人切身利益。为了促进转基因食品健康发展，各国政府对转基因 食品研制、生产及销售环节都制定相关管理条例，转基因食品标识也被欧、美及我国政府列 为强制性措施。转基因食品标识制度能否顺利实行关键在于能否建立准确可靠转基因食品鉴 别技术。利用PCR方法检测转基因食品中外源基因是目前国内外常用转基因食品鉴别技术， 因而PCR技术在转基因食品检测中越来越显重要。但PCR准确性仍受很多因素影响如，提取 DNA性质，PCR反应抑制物等，但随着该项技术的逐渐成熟和完善，其检测结果也将越来越

15、准确可靠，对现有或新出现的转基因食品都能进行快速、准确地检测。所以在实际应用中， PCR检测转基因食品方法不断被改进。转基因食品作为一种新食品，其食用安全性目前尚无定论，从食品安全的角度，需要对 其进行检测，而目前的PCR技术在转基因食品中的应用，也仅是可以检测出是否含有外源 DNA即转基因成分，对于人们所关心的安全的问题并不能检出，所以目前也常与其它的方法 结合，女口，PCR-SSCP，现代遗传学研究中用于检测基因点突变和短序列缺失与插入的一种工 具14。5小结通过以上PCR技术在转基因食品中的应用，我认为PCR技术可以加快实现它的工程化， 效益化，不仅是在食品领域，还有农业，医学等领域。其

16、实在这些领域都已有PCR技术相关 的报道。如，PCR技术在肿瘤上的应用15，及传统的生物发酵技术上可以结合PCR技术，利 用DNA的体外复制，实现表达，还有就是现代环境工程污水处理的微生物载体研究。大多数基因都是以基因家族的形式出现，而以基因家族出现的基因往往具有一定的相似 性，通过比较，就可找到保守序列和可变序列，从而可通过PCR技术检测到新的基因。PCR 技术作为一项“革命性的技术”，不仅推动了遗传与分子生物学的发展。而且，在其他领域 科学家的努力与创新下也得到了很好的应用。总之，随着科学技术的不断进步，PCR技术必 将得到新的发展，以之为基础的新技术将不断出现。参考文献Xu Wen-Ta

17、o,Huang Kun-Lun,Deng Ai-Ke and Luo Yun-Bo, PCR for the detection of the anti-herbicide genes in genetically modified organismsJChinese Journal of Agricultural Biotechnology,2005,13:601-607.高贵田，李冰，张宝善，孙翔宇.PCR技术基本原理教学方法J农产品加工学刊，2012， .廖友媛转基因食品的安全性与发展前景分析J株洲工学院学报,2004,(3):93-94.杨萍，高伟.转基因食品及其安全性J.农业与技术,

18、2005(4):139-141.Robinso.Simon.Europe plans stricter rules for GMOSJ.ICIS Chemical Business,2006,(4);11T1.周欣宇转基因食品在中国食之有惑N.华夏人文地理，2005,(5):100-105.Gachet E,Martin G G.Detection of genetically modified organisms by PCR:a brief review of methodologies availableJ.Trends in food Science and Technology,1999,(9):380-388.徐茂军转基因植物食品的检测策略J.食品与发酵工业，2001,27 (12)： 69-74.刘光明多重PCR方法检测食品中转基因成分J.无锡轻工大学学报，2002,21 (4)； 379-383.曹际娟.PCR检测转基因玉米及其粗加工食品J.玉米科学，2001,9 (2)； 87-91.刘恒,郑文杰，赵卫东等。转基因大豆检测芯片的研究J.中国食品卫生杂志,2005,17(2)； 131-134.栾凤侠，张洪祥，徐宝梁等，高分子量谷蛋白亚基转基因小麦检测技术的研究J. 东北农业大学学报，2005，36 (