抗菌肽生产关键技术及其产业化

1、 3抗菌肽生产关键技术及其产业化吴松刚施巧琴郑 毅黄建忠术国家工程争辩中心福州350108赵燕玉蔡玉凤孙 艳 黄钦耿福建省麦丹生物集团福州争辩院福州3501071.0 技术背景抗菌肽具有多种成效，可替代对人类安康有危害的抗生素和抗菌类效价的抗菌肽产品。随着社会的进展和人们的生活水平提高，更多的人越来越关心食物目前，全部的常规抗生素都消灭了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严峻地威逼着人们的安康。随着抗生素的大量广泛用于饲料中和人们对食品和环境质量的要求越来越高，人们对抗生素的副作用生疏日益加深，抗生素在饲料业中的应用，已面临着淘汰或禁202241饲料添加剂。很多国家对抗生素、化学

2、合成药品的使用、淘汰、畜产品中的药物残留作了格外严格的限定，并致力于开发和推广无害的绿色饲料添加剂，以生产出安全牢靠的食品“绿色畜产品需求。人们正从自然物质中查找抱负的无毒、无残留、高效广谱、抗菌促生长的绿色饲料添加剂，并应用于养殖生产。我国也已经开头限制抗生素在饲料中的添加和用量，应用无毒无公害的型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。随着我国进入 WTO，抗生素作饲料添加剂必将严峻影响畜产品在国际市场的竞争力，借助生物高科技的最成果，研发对环境友好型的、绿色环保的多肽类生物添加剂及抗生素替代剂，彻底扭转和杜绝滥用抗菌素和激素类添加物的问题，是提高人类安康水平

3、、促进生产和生活质量需要迫切解决的课题。抗菌肽( Antibacterial peptide) 又叫抗微生物肽(Antimicrobialpeptide) 、抗生素肽(Antibiotics peptide) 。抗菌肽是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽, 其生成和释放是机体炎症反响的组成局部, 是宿主防范病原微生物入侵的重要分子屏障。抗菌肽具有分子量低、水溶性好、热稳定、强碱性和广谱抗菌等特Boman 从天蚕的免疫血淋巴中纯化, 而后又在哺乳动800 多种。微生物来源的抗菌肽是抗菌肽家族中的重要一员 , 它能特异性杀死肽、多黏菌素和乳酸链球菌肽等。如 Lantibiotic 是革兰阳性

4、菌产生的抗菌肽, 乳链菌肽 nisin 是其中争辩最为清楚的 lantibiotic 类抗菌肽。一些由真菌产生的抗菌肽, 如哌珀霉素类( peptaibol) 抗菌肽, 主要由木霉属土壤真菌产生。和提取具有抗菌活性的肽类物质。我国抗菌肽生产菌株普遍承受枯草芽孢杆菌，其产生的是一种混合多肽, A, A” ,B, C, D, E, F, F1, F2, F3, GA 组分是其中生物活性最高也是最重要的组分, 通常称之为杆菌肽 Gramicidina, 分子式为C66H103N17O16S, 其构造是由 12 个氨基酸组成的多肽。具有环状构造, 分子中含有 D-和L木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶等具有很大

5、的抗性, 也不受蛋白酶抑制剂的影响。与其它抗生素比较, 这是一个优点。假设把杆菌肽制成锌盐或亚甲基水杨酸盐, 就比自然产品要稳定得多。杆菌肽对多种革兰氏阳性病原菌, 如葡萄球菌、溶血性链球菌、微型球菌、藤黄八叠菌、非溶血性链球菌、魏氏梭菌、放线菌以及局部革兰氏阴性菌均有较强抑制作用。杆菌肽的作用机理是由于能抑制细胞壁所合成的脱磷化过程 , 影响一方面是与敏感菌的细胞膜结合损伤细胞膜使细胞膜的通透性增加导致内粘质外流; 其次是干扰敏感菌细胞内原浆蛋白的合成。抗菌肽通过摧毁细菌的细胞膜起杀灭作用近年来, 杆菌肽制剂在动物饲料添加剂上的应用取得了巨大的成功 ,杆菌肽锌( Bac-itracin Zi

6、ne)被美国首先批准作饲料添加剂使用以来, 1990 年批准生产与使用国内产品。抗菌肽生产关键技术高效价抗菌肽菌株的筛选在从昆虫及试样中分别出产抗菌肽的细菌菌株共 156 株,经鉴别其中:短杆菌 48 株、芽孢杆菌 66 株及乳酸链球菌 42 株,在初筛过程中，发酵5000 /ml36822及乳酸链球菌 6 株,经复筛有 15 株发酵效价在 5000/mlT-104510453.3/ml，T-1278，T-2856及T-30339926.6 /ml。4 101 高效价抗菌肽菌株的筛选结果之一菌号ODpH效价 /ml菌落形态0.2155.54T-10080.2165.496915.90.2145

7、.530.2445.50T-10430.2265.496916.90.2235.520.2155.63T-10450.2135.6210453.3较大0.2135.620.2195.43T-12110.2275.538952.80.2075.540.2415.48T-12780.2165.559926.60.2265.510.2345.54T-12980.2405.537668.20.2445.520.2355.52T-13440.2585.535073.6中等0.2525.520.2645.54T-15760.2395.567668.20.2365.52较小表2高效价抗菌肽菌株的筛选结果之二

8、较小0.2435.44T-15880.2335.517556.40.2405.500.2455.51T-15920.2525.507668.20.2465.510.2385.49T-18790.2265.607668.20.2355.490.2575.52T-19660.2365.567668.20.2725.490.2475.55T-28560.2455.629926.60.2385.660.2665.49T-29360.2625.478952.80.2445.470.2425.44T-30330.2555.449926.60.2495.44T-1045T-1045 菌株种子培育基配方四因素

9、七水平均匀法设计方案表3种子培育基配方四因素七水平均匀法设计方案%因子蔗糖糖蜜玉米浆粉硫酸铵N12.004.202.200.50N22.603.802.000.65N31.804.000.900.70N41.404.801.500.60N52.203.001.300.55N62.404.401.100.45N71.603.401.700.40T-1045 菌株种子培育基配方四因素七水平均匀法试验结果16h20h24h项16h20h24h项目ODpHODpHODpHN10.3066.280.3197.340.2907.94N20.2886.220.3356.380.3067.91N30.3436

10、.020.2885.810.3237.05N40.2546.050.2887.280.2927.60N50.2585.990.3286.910.3567.29N60.2766.120.2936.030.3517.08N70.2716.110.2727.620.2717.53培育基成份表5四因素七水平均匀法试验结果之二培育基成份配方配方编号培育时间蔗糖糖蜜玉米浆粉硫酸铵N-3N-1616h1.801.404.004.760.902.20.700.70种子配方N-2N-2020h2.602.603.804.802.002.20.650.70N-520h24h2.203.001.300.55N-24

11、24h2.584.000.90.51发酵配方一25h3.505.300.840.60注：N16、N20、N24 16h、20h、24h 理论拟合结果表6四因素七水平均匀法试验结果之三种子培育时间配方编号OD*50pHOD*100pH效价( /ml)0.1946.01N-30.2865.810.2045.94833316h0.1985.870.1866.13N-160.3067.160.1866.1485760.1916.110.2125.93N-20.3247.560.1825.9084760.2125.940.2106.3220hN-50.2957.150.2046.3793040.2076

12、.440.1765.96N-200.3626.560.2015.89116670.2025.920.1856.33N-50.326.720.1756.4191060.1716.3224h0.2045.97N-240.3496.190.2085.9493670.2215.93上述结果说明:种子 N-20 配方，发酵 20h，效价最高达 11667/ml。T-1045 菌株种子及发酵培育基综合优化结果T-1045表7T-1045菌株种子培育基综合优化结果配方PHOD生物量效价(/ml)1016.990.28338.0%173001025.450.11514.0%147301036.820.2171

13、7.4%150061047.780.24820.6%10767原配方6.420.12710.0%11868T-1045表8T-1045菌株发酵培育基优化结果配方编号PHOD生物量效价(/ml)2016.700.24316%242802025.470.20811%256702036.400.29616%23450原配方7.150.31414%11966T-1045配方编号平均效价(/ml)30127623302配方编号平均效价(/ml)3012762330224809303214313049703原配方11789PHOD生物量效价(/ml)7.350.43722%276707.400.44222

14、%275766.380.16511%248066.340.17411%248117.310.39223%214957.280.39427%213677.110.42926%97307.110.38926%96756.020.20712%117956.060.20312%118056.110.20212%11766上述结果说明:种子培育基以编号 101 最高,达 17300/ml,发酵培育基以编号 202 最高,达 25670 /ml,综合优化培育基以编号 301 最高,达27623 /ml，比原配方 11789/ml，提高了 134.3%，效果极为显著，实现了预定的技术指标。T-1045 菌株

15、发酵配方优化及产品载体比较种子培育结果发酵培育结果配方编号种子培养时间发酵培种子培育结果发酵培育结果配方编号种子培养时间发酵培养时间ODPHODPH效价(/ml)40124h0.1876.3848h0.2907.492096040224h0.1976.7530h0.1946.731835740320h0.1246.4425h0.2155.1321505配方编号湿样干样401402403配方编号湿样干样401402403载体水分%效价/g水分%效价/g膨化玉米44.58851313.7316625麸皮49.9662319.2518944膨化玉米49.36630813.6014590麸皮52.40

16、33359.9616625膨化玉米41.83887111.9518944麸皮49.1165227.0319752上述结果说明:T-1045 菌株发酵配方优化以编号 403 配方为最正确，发酵效21505/ml。体，但麸皮效价稍高。抗菌肽产品稳定性试验24 个月在室温条件下的效251。12抗菌肽产品在室温条件下的效价变化年-月月平均温度效价/g2022-1025.3225002022-1121.9220222022-1219.0210002022-0112.9202202022-0214.3195002022-0317.2193002022-0423.5190002022-0525.418800

17、2022-0631.7185002022-0732.6181002022-0832.5176002022-0929.7175002022-1025.5170002022-1122.5165002022-1216.2161002022-0113.3157002022-0213.0150002022-0316.6143002022-0422.4140002022-0526.0120222022-0629.6110402022-0733.4105402022-0832.0101402022-0929.61004040.02500040.02500035.0温度效价2022030.0度温25.0150

18、0020.0/u10000价效15.010.050005.00.00年-月201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201201 201 201201 201 1. 抗菌肽产品在室温条件下的效价变化上述结果说明 :抗菌肽产品在室温条件下，经 2 年时间起始效价由22500/g下降到10040/g55.4%1年的下降率仅%说明该产品具有相当好的稳定性，此项试验仍在连续进展中。抗菌肽应用效果抗菌肽对仔猪喂养试验及其效果试验分组：承受单因子浓度梯度法设计，试验设 2 组：比照组、0.3%生物抗菌肽组

19、。每个组设 4 个重复，每个重复 12 头仔猪下表。试验分组序号工程比照组试验组1生物抗菌肽添加水平00.3%2仔猪头数头4848试验材料：试验选用 28 日龄断奶、遗传背景一样、体重相近的仔猪随机分组。效价：8320/g试验日粮：直接加到协作饲料中制粒或拌料饲喂。试验时间：2022152430试验状况：按猪场正常饲养治理程序进展，试验期间自由采食、饮水，正试期间24h 后空腹称重。经过 30 天的饲养试验，仔猪未消灭疫情，没有消灭死亡现象。仔猪腹泻方面，比照组间或有小猪腹泻，但状况不严峻，康复较快，而试验组未腹泻现象极少。从皮毛质量方面看，试验组明显好于1：序号表13抗菌肽对仔猪养殖试验效果工程比照组试验组1生物制剂添加水平00.3%2仔猪头数头48483初始总重kg4364384初始均重kg/头9.109.135总耗料量kg98611026日均采食量kg/头.天 0.6850.7657试验末总重kg104511838试验末均重kg/头21.7724.659总增重kg60974510平均日增重kg/天0.4230.51811料肉比1.621.483.1.7试验结果分析由上表试验数据我们可