蛋白质组学新技术课件

1、蛋白质组学新技术-DIGE 主讲：胡水旺 南方医科大学病理生理学教研室 E-mail： QQ:4934488582012年9月第一部分：背景知识生命科学研究的目标寻找生命活动的起源及奥秘，解释及探索生命活动的一般规律，改善人类生活质量，延长人类寿命。 系统生物学 系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成分（基因、mRNA、蛋白质等）的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科 。组学实验理论计算基因组转录组蛋白质组相互作用组代谢组表型组数据整合模型构建系统干涉合成生物学系统生物学研究的两大技术方法：组学实验和理论计算系统生物学应用举例 应用系统生物学的方法可以预测药物的作用机制、病人对药

2、物的应答，包括毒副作用和疗效等。 例如，美国纽约基因网络科学公司（Gene Network Sciences）构建了一种人类癌细胞模型，该模型内含有500多种基因和蛋白质，可将以前分别孤立研究的生物过程联系在一起，利用该生物网络模型，能够更好地理解细胞的生物学行为。解析疾病机制手段的改进:DNA Protein 蛋白质表达调控转录水平调控翻译水平调控翻译后水平调控 蛋白质存在复杂的翻译后修饰，作为生命功能的直接行使者，它比基因更能直接地反映生理过程及其变化。 蛋白质相互作用及空间构向等问题是生命现象复杂性的真实体现。蛋白质研究的复杂性蛋白质研究的复杂性细胞周期信号转导图 随着人类基因组计划重点

3、由结构基因组到功能基因组的转移，生命科学开始进入后基因组时代。 研究基因终产物及生命活动直接功能执行者蛋白质的科学-蛋白质组学（Proteomics）应运而生。 蛋白质组学(Proteomics) ：是通过大规模研究蛋白质的表达水平的变化、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用，以获取蛋白质水平上疾病变化、细胞进程及蛋白质网络相互作用的整体综合信息的科学研究。 疾病蛋白质组学：蛋白质组学用于研究疾病发病机制便发展为疾病蛋白质组学。2001年， Nature 、Science杂志分别发表了“And now for the proteome”和“Proteomics in Genome land

4、”，把蛋白质组学列为21世纪六大研究热点之一。2001年，有美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（HPO），并制定了人类蛋白质组计划 （Human proteome project，HPP）。2003年4月14日，科学家宣布人类基因组计划已经顺利完成，99%的人类遗传密码被破译，人类基因组图谱提前2年完成。蛋白质组学被进一步提上日程。 蛋白质组最早是由澳大利亚Macquarie 大学的Wilkins和 Williams在1994年的意大利举办的双向电泳会议上首次提出来的。 Proteome一词由“蛋白质（PROTEin）”与“基因组（genOME）”杂合而成，对于“基因组学（Genomics）”

5、,“蛋白质组学”定义为一个基因组所表达的全套蛋白质。由Proteome进一步派生出Proteomics。蛋白质组学的研究内容1.蛋白质：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、蛋白质差异显示、同工体比较、新型蛋白质发掘和数据库构建。2.基因：完善功能基因组计划。3.重要生命活动的分子机制：细胞周期、肿瘤的发生发展、物种进化等。4.医药靶分子的寻找与分析：新型药物靶标、肿瘤恶性标志物。蛋白质组学的研究任务1.诠释基因功能；2.寻找功能蛋白质：如LPS刺激；3.研究生理和病理现象:如肿瘤；4.开发蛋白质资源：如EPO、胰岛素等；5.进行基础研究：如贺福初院士领衔的“国际人类肝脏蛋白质组计划”。背景知识 蛋

6、白质组学的研究的机遇和挑战： 机遇：基因组计划的快速进行，大量基因序列和EST的确定为蛋白质的快速鉴定提供了良好的基础。 挑战：从单一蛋白质的研究转变到细胞和组织的整体蛋白质研究，在理论和技术上提出了挑战。 蛋白质研究技术的革命：蛋白质组学蛋白质组学常用的两大技术平台IPGphor IEF UnitDALT Six Unit双向电泳原理2. 第二向SDS：SDS PAGE是根据蛋白和多肽的分子量大小将其分离的。它是在含有十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶中进行的。由于SDS 掩蔽了蛋白本身所带的电荷，同时形成了阴离子复合物，使单位质量的蛋白带有大约相等的阴离子电荷。SDS第一向等点聚焦系

7、统组件 Ettan IPGphor等电聚焦系统包括： 1.Immobiline DryStrip干胶条，含固相pH梯度，通常称为IPG胶条； 2.两种胶条固定附件Manifold 胶条槽和固定长度式胶条槽； 3.Ettan IPGphor 电泳仪，包括一个高压直流电源、珀耳帖（Peltier）固相温控装置、和可同时设定10 种IEF 方案的程控系统。第一向：水化1. 用移液器吸取适量制备好的DeStreak 水化溶液，至泡胀盘中或常规胶条槽中，将溶液沿槽道的全长均匀分布。2. 从阳极开始（+ 端），小心揭去Immobiline DryStrip 干胶条的覆盖膜。3. 小心地将Immobilin

8、e DryStrip 胶条放入盘/ 槽中，面冲下将水化溶液仔细地均匀分布于胶条下。要使凝胶完全被覆盖，可轻轻地抬起按下胶条，并在溶液表面前后滑动。注意不要在胶条下面产生气泡。4. 用Immobiline DryStrip 覆盖油覆盖胶条。5. 溶胀时间1020 小时。第一向：加样 Manifold 胶条槽可容纳724cm 长的胶条，最多同时容纳12 条，主要可通过三种方式上样：（1） 水化上样，通常用于制备和分析电泳，适用于宽范围或窄范围胶条；（2） 样本杯上样（阳极或阴极），通常用于分析电泳，适用于碱性或强酸性胶条；（3） 纸桥上样（阳极或阴极），通常用于制备电泳，适用于碱性或强酸性胶条。

9、标准胶条槽：采用水化上样，泡涨和上样一次完成。第一向：聚焦参数设置 根据胶条的pH梯度范围、胶条长度及上样量来确定聚焦参数。一般是先主动水化，以24cm pH 3-11 NL的胶条举例，参数设置如下： 30v， 12hr； step 100v，1hr； gradient 1000v，1hr； gradient 8000v，2hr； Step 8000v，50kvhr； step 500v，10hr。等电聚焦流程图第二向SDSSDS电泳由四步骤组成：1) 灌胶2) 在SDS 平衡缓冲液中平衡胶条3) 将平衡好的胶条放置在SDS 凝胶上4)第二向电泳系统的准备并进行电泳样品制备原则 样品制备是双向

10、电泳中最关键的一步，质量的好坏将直接影响2-DE结果。尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则： 1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最 大量的总蛋白，减少蛋白质的损失； 2）减少对蛋白质的人为修饰； 3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作 用，并使蛋白质处于完全变性状态。 样品制备需要的试剂样品制备需要四种主要的试剂：1.离液剂：主要包括尿素和硫脲；2.表面活性剂，也称去垢剂：早期常使用NP-40、TritonX-100等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS等双性离子去垢剂；3.还原剂最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）4.其它：可

11、以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA、PMSF 或 Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。 一般样品处理过程1.细胞破碎、避免蛋白水解、样本分级2.蛋白质沉淀和去除干扰物质3. 裂解：样本制备过程会使用高浓度尿素（或联合使用尿素和硫脲）和一种或多种去污剂。样品制备注意事项1.加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶降解目的蛋白；2.操作尽量迅速，尽量在4 进行；3.除去核酸时最好用超声，尽量避免产生气泡；4.用超速离心除去脂类和多糖干扰；5.尽量避免引入盐离子，可以用水化时加入电极片的方法除去一些盐离子；6.定量要求准确，可以用2D Quant kit

12、定量，也可用Bradford 方法定量。样品分装后-80冻存。目前双向电泳面临的挑战 灵敏度低 线性动态范围窄 重复性差 定量精确性不够DIGE 技术的发展历史 DIGE ( Difference gel electrophoresis ) 技术最早在 1997 年由 Jon Minden 实验室的 Unlu等提出，后来 Amresham 成为此技术主要推动者。 2002年 Gharbis 等巧妙的将所有实 验组的样品等量混合为内标用在每块胶上。不久，Amresham公司便将内标作为DIGE实验设计核心原则之一 ， 从而使DIGE 发展成为更加趋于成熟的体系。 EttanTM DIGE 工作流

13、程2D 分离Cy5用Typhoon多功能扫描成像系统采集凝胶图像Cy3Cy2用DeCyder全自动差异分析软件进行图像分析和数据定量样品被分别标记后混合样品1用Cy3标记混合内标样品 用 Cy2标记样品2用Cy5标记DIGE 内标（Internal standard） 内标为实验中的每张胶上的每个蛋白质都提供了一个参考点。理想情况下，内标中最好含有来源于所有样本的每一个蛋白质。 最好的办法就是将所有的样本等量混合来形成内标。 C1 C2 C3 T4 T5 T6Pooled sample (internal standard)Why we use the internal standard?Workflow of DIGEWorkflow of DIGEWorkflow of DIGEWorkflow of DIGEWorkflow of DIGEWorkflow of DIGEWorkflow of DIGEWorkflow of DIGEWorkflow of DIGEWorkflow of DIGE从凝胶上取一个区域转换成三维图像Workflow of DI