非病毒基因载体的研究进展课件

1、非病毒基因载体的研究进展面 临 的 挑 战概述常 用 材 料概述2概述人类基因组DNA序列工作框架图的完成，标志着功能基因组时代的到来。人类对自身基因的功能，特别是与疾病相关的基因的了解更加深入，这对基因治疗的研究将产生巨大的推动作用。目前进行研究的载体主要有两类：病毒载体和非病毒载体病毒可以高效率地进入特定的细胞类型，复制所携带DNA并表达自身蛋白产生新的病毒粒子，因此首先被改造作为基因治疗的载体。据统计，目前已经采用基因治疗的病例中，约有80%所选用的是病毒载体，虽然病毒作为基因运送载体已经使用很多，但仍然存在着危险性，如免疫原性(immunogenicity)和病毒性重组(viral r

2、ecombination)等安全性问题。由于运送载体的局限性使得目前对疾病基因治疗的目标无法完美实现。因此，研究和开发新型有效的基因运送载体是众多研究人员及临床医生的关注热点。2022/10/133概述人类基因组DNA序列工作框架图的完成，标志着功能基因组时代的到来。人类对自身基因的功能，特别是与疾病相关的基因的了解更加深入，这对基因治疗的研究将产生巨大的推动作用。此外，病毒载体自身容量有限，制备滴度不高。非病毒载体与之相比虽然转染效率有限，但是具有无传染性、不限制载体容量、化学结构可控制以及可大量制备等优点而越来越受到研究者的青睐。由于运送载体的局限性使得目前对疾病基因治疗的目标无法完美实现

3、。因此，研究和开发新型有效的基因运送载体是众多研究人员及临床医生的关注热点。2022/10/134?非病毒基因载体定义：非病毒载体是利用非病毒的载体材料的物化性质来介导基因的转移。优点：无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制，且易于大量制备。缺点：转导效率低，目的基因只能实现瞬间表达，其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。5一、改性天然高分子3 2多糖类载体蛋白质类载体1脂质类载体脂质类载体脂质体一般带一个疏水基团，有利于形成脂双层结构，保护分子中的疏水部分，将氨基端的基团暴露于水介质中氨基通过静电引力与DNA结合并将DNA大分子压缩成可运输的小单元，形成脂质

4、体复合物增加每分子中氨基的数目及增长氨基和疏水基团间的距离对基因的运送释放是有利的，较大的脂质体能够促进体外转染阳离子型脂质体载体使用方法：1、静脉注射，提高诊疗性蛋白质的表达水平，2、口服，很快被原生质清除并累积于肺组织，解决办法：PEG包覆及使用靶向配体。目前已经应用于基因治疗的非病毒载体绝大多数是阳离子脂质体，原因可能是促进复合物与负电性的细胞壁结合。2022/10/138 二、合成高分子载体拟病毒载体聚酰氨基胺和含磷的树枝状化合物聚赖氨酸聚乙烯亚胺PLGA壳聚糖101、聚赖氨酸聚(L-赖氨酸)是最早用于基因运送的阳离子聚合物之一。能够被体内的胰蛋白酶降解生成人体内存在的氨基酸，因此没有

5、滞留的危害性。需加入裂解胞内体的试剂或溶酶体类(如氯喹等)的试剂，使用受体介导的聚(L-赖氨酸)转入基因的活性比较高。此外，各种其它的聚(L-赖氨酸)共聚物，如并入了L-色氨酸、接枝聚(L-组氨酸)等转移基因进入哺乳动物细胞的实验也都证明其良好的性能。分枝的和线性的聚乙烯亚胺既不需要裂解胞内体的试剂也不需要溶酶体类或是任何易于受体介导的试剂。主要原因可能是PEI自身易于逃离胞内体(质子泵效应)。对PEI活性的影响：目前最优的分子量在11.970kDa之间。对细胞具有毒性，主要是由于其对细胞膜有较高的亲和粘附所致。运载的基因表达期短暂，静脉注射后转染主要发生于肺部。PEG包覆使肝脏中转染作用增强

6、，并减小PEI对细胞的毒性。壳聚糖/DNA络合物有良好的低免疫性，壳聚糖还可以有效地加强抗原的免疫原性，诱发抗原特定IgG、分泌IgA、毒素中和抗体以及T细胞的反应。聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)共聚物体内可实现局部基因转染和表达，作用比阳离子脂质体介导的基因转染稍强；但该载体的包埋率仅有0.9%。聚酰氨基胺和含磷的树枝状化合物末端氨基通过静电作用连接DNA，末端氨基数目的增加能够增强对基因的运送 释放的能力。酰胺键在水或乙醇中的水解，可使基因转染率增加50倍,原因可能是增加了聚合物的柔韧性。研究还发现，这种增加的柔韧性对吞噬泡的膨胀至关重要。12非病毒载体面临的挑战 要提高复合物的细胞靶向性，增强与细胞膜的作用。1、连接靶向配体2、载体材料的结构修饰3、赋予纳米粒“隐形”的特性提高细胞对载体-基因复合物的摄取非病毒载体介导的基因转染效率不高，主要是外源基因难以有效的导入到细胞核，导致基因在细胞质中被核酸酶降解。核蛋白定位 信号能有效的介导蛋白或者核酸的跨核膜转运。目前常用的NLS有鱼精蛋白，低相对分子质量的鱼精 蛋白提高目的基因的跨膜转运促进载体基因复合物从内涵体溶酶体释放