核酸分子杂交七年制

关于核酸分子杂交七年制第1页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五核酸分子杂交（nucleicacidmolecularhybridization）是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。探针(probe)：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。第2页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床基因诊断上的应用也日趋增多。检测对象:

克隆化的基因组DNA,、细胞总DNA、总RNA。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。核酸分子杂交特点：高度的灵敏性(pg)

、高度的特异性第3页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五第一节核酸分子杂交的基本原理一、变性（denaturation）二、复性（renaturation）三、杂交（hybridization）四、预杂交（prehybridization）第4页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五

基本原理：DNA变性、复性与分子杂交第5页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五Hybridization第6页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五Tm：50%DNA解链的温度，又称融解温度。（G、C含量）Tm=69.3+0.41*(G+C)%融解温度：50％杂化核酸分子解链温度称为寡核苷酸探针的Tm值。寡核苷酸探针的长度、碱基的含量和核酸的序列决定了探针的Tm值。实际操作中，常选择低于Tm值5-10℃进行杂交。

Tm=4℃X（G+C）+2℃X（A+T）第7页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五杂交温度：Tm=81.5℃+161.6logM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺%）M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性

例如，一个长度为500bp的探针，（G+C）含量为50%，杂交体系中含5XSSC（0.75mol/LNa+）和50%甲酰胺，则其Tm值为：

Tm=81.5℃+(-2.07)+20.5–1–30.5=68.4℃50%甲酰胺溶液,温度一般选择低于Tm值20-25℃杂交温度应:68.4℃-25℃=43.2℃甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核酸杂交的Tm值，50%的甲酰胺可以使Tm降低30℃第8页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五5’3’5’3’5’3’5’3’影响核酸分子杂交的因素探针的浓度、长度、复杂性离子强度温度与变性剂（甲酰胺）杂交条件的严谨性

第9页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五预杂交prehybridization概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。常用的封闭物：（1）变性的非特异性DNA:如鲑鱼精DNA、小牛胸腺DNA，又称为覆盖DNA。（2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400、脱脂奶粉第10页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五基本实验步骤：electrophoresisTransferBlockblocksubstrateprobeMigrationhybridization第11页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五第二节核酸探针probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。

核酸探针的类型核酸探针的标记方法核酸探针的检测第12页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五按化学本质分：DNA探针

RNA探针

按标记物分：放射性标记探针核酸探针的类型

3H、32P、35S、125I等优点：高特异性，高灵敏度缺点：存在放射性污染，半衰期短非放射性标记探针生物素，地高辛、荧光素等第13页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五常用的探针标记法：（1）化学标记法：光敏生物素标记法（2）酶促标记法：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。切刻平移法、随机引物法、末端标记法等第14页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五光敏生物素标记法:强光10-20分钟，光敏基团与核酸探针的磷酸基团以共价键结合。第15页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五（2）酶促标记法：

将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。

缺口平移法、随机引物法、末端标记法等32P或35S同位素标记的单核苷酸dig-dUTP的结构第16页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五（1）缺口平移法由DNA酶Ⅰ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。DNA酶Ⅰ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-OH端大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’外切核酸酶活性（nicktranslation）“边切除、边聚合”第17页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五最合适的缺口平移片段一般为50-500个核苷酸。DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶Ⅰ的质量会影响产物片段的大小。DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。第18页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五随机引物（4-6nt）：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段：

5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性无5’→3’外切核酸酶活性（2）随机引物法（randompriming）第19页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五产物平均长度为400-600个核苷酸。Klenow片段没有5’→3’外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。第20页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五（3）探针的末端标记：在5’或3’端通过酶促反应加上标记物酶切第21页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五核酸探针检测方法同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号

放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来检测杂交信号。取出杂交膜，在Whatman滤纸上晾干，用保鲜膜包好，在暗室中置于X线片上，加增感屏，固定于暗盒内，-70℃曝光适当时间（1-7天），在暗室中取出X线片，显影、定影，即可在X线片上读出杂交带。第22页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五非放射性标记探针：偶联反应+显色反应Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联Dig-DNA探针

+抗Dig抗体-碱性磷酸酶（AP）

或辣根过氧化物酶（HRP）

+底物：BCIP+NBT蓝紫色或DAB红棕色；TMB

蓝色第23页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五核酸分子杂交的分类第三节核酸分子杂交技术第24页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五一、膜上印迹杂交

印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固相支持物上的方法。指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。第25页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五1．固相支持物的选择特点：较强的结合核酸的能力（>10μg/cm2）;

与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应;

与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等；非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉;

具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。常用的固相支持物：

硝酸纤维膜（NC）、尼龙膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等第26页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五固相支持物的选择良好的固相支持物应具备的条件：具有较强的结合核酸分子的能力（>10μg/cm2）与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应与核酸分子结合牢固非特异性吸附少具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作常用的固相支持物硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等第27页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五第28页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五第29页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五第30页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五2．印迹方法Mechanicsoftransfer虹吸印迹法（Capillary）真空转移法（Vacuum）电转移法（Electrophoretic）BlotDNAtomembrane第31页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五

CapillaryBlotting(upward)

nospecialequipmentrequired!1975年E.SouthernSouthernDNA印迹转移技术DNA片段<1kb，1小时DNA片段>15kb，18小时第32页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五Electrophoreticblotting不宜用硝酸纤维素膜一般2~3小时，最多6~8小时especiallygoodforsmallfragmentsresolvedbyPAGE第33页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五Vacuumblotting30~60分钟moreefficientandquantitativethancapillarymustapplyvacuumevenlyandnottoostrongly第34页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五3．印迹类型Southern印迹杂交

Northern印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交反向斑点杂交菌落或噬菌斑杂交第35页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜，高温烘烤与DNA或RNA探针杂交放射自显影Southernblottinghybridization

检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因。可用于基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。预杂交第36页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五PaperTowelsSouthernBlottinghybridizationtissueSDSProtKPhenolChloroSpin提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性、转移到NC膜与DNA或RNA探针杂交放射自显影第37页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五Prehyb/Hybridization/Rinses第38页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五

检测靶分子为DNA,

检测靶分子是否含有目的基因。DNA指纹图谱Southern印迹杂交的应用：

第39页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五Northernblottinghybridization检测靶分子为RNARNA极易被RNase降解RNA酶抑制剂0.1%DEPC处理水(焦碳酸二乙酯)第40页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五与Southern

blotting

hybridization不同之处：不需要限制性核酸内切酶酶切。变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。应用：检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。Northernblottinghybridization第41页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartmuscleGEFmRNASouthernblottinghybridization第42页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五优点：简单、迅速（直接点样）；可在同一张膜上进行多个样品的检测；应用：同一种样品经不同倍数的稀释,可以得到半定量的结果；核酸粗提样品的检测效果也较好。Dotandslotblottinghybridization将变性后的DNA或RNA直接点样与膜上第43页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五Reversedothybridization

直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断DNA是否含有这些探针的同源序列。DNAchip第44页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五Colonyorphagehybridization

从重组DNA文库中筛选阳性克隆

第45页，共49页，2022年，5月20日，3点36分，星期五二、核酸原