重组DNA技术课件

第二十章重组DNA技术recombinantDNAtechnique第二十章重组DNA技术recombinantDNAtec第一节

重组DNA技术的基本过程

BasicProcessofRecombinantDNATechnology*2第一节

重组DNA技术的基本过程

BasicPro一、重组DNA技术相关概念重组DNA技术（RecombinantDNATechnology）：是在体外将不同来源的特异基因或

DNA片段插入载体分子，构建成重组DNA分子；并将它导入到合适的受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，筛选出含有目的基因的转化子细胞；再进行扩增、获取大量同一DNA分子。*3

亦称DNA克隆(DNAcloning)，或基因克隆(genecloning)。一、重组DNA技术相关概念重组DNA技术（Recombi克隆化(cloning)：

获取这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。重组DNA(recombinantDNA,)：又称嵌合DNA（chimeraDNA），采用克隆技术把来自不同生物的外源DNA插入载体分子所形成的杂合DNA分子。*4克隆(clone)：

指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体；克隆化(cloning)：重组DNA(recombinant分－－分离目的基因并进行必要的改造切－－限制酶切目的基因与载体接－－拼接目的基因与载体成重组载体转－－将重组载体转导入受体细胞筛－－筛选出含重组DNA的细胞等二、DNA重组技术基本程序*5思考题1分－－分离目的基因并进行必要的改造切－－限制酶切目的基因与载重组DNA技术的基本过程（1）*6重组DNA技术的基本过程（1）*6重组DNA技术的基本过程（2）*7思考题1重组DNA技术的基本过程（2）*7思考题1*8CommonEnzymesUsedinRecombinantDNATechnology第二节

重组DNA技术中常用工具酶*8CommonEnzymesUsedinRecom一、限制性核酸内切酶

（restrictonEndonuclease）

是一类能识别双链DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶，又称为限制酶（restrictionenzyme）。主要是从原核生物中分离纯化而来。——基因工程的手术刀----“切”与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。*9一、限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中的第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。（一）限制酶的命名：HindⅢ

属种株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶一、限制性核酸内切酶*10第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；（一）限制Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相对分子量较大的多亚基蛋白质复合物，同时具有内切酶和甲基化酶活性，反应过程中需有Mg2+和ATP参与。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（基因工程技术中常用Ⅱ型）。（二）限制酶的分类：Ⅱ型限制酶通常以同源二聚体形式存在，只具有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中只需有Mg2+参与而不需有ATP参与。*11Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相对分子量较大的多亚基蛋白质复合物，同时Ⅱ类酶识别序具有回文结构(palindrome)特点，

即具有双重旋转对称结构的DNA反向重复双链序列。（三）Ⅱ型限制酶的作用特点：1.基本特性：大部分Ⅱ型限制酶都能识别由4~8个核苷酸组成的特定序列。*12思考题2Ⅱ类酶识别序具有回文结构(palindrome)特点*13图20-3限制酶EcoRⅠ对双链DNA分子的切割作用*13图20-3限制酶EcoRⅠ对双链DNA分子的切割作BamHⅠGGATCCCCTAGGGTCCAGGACCTG+平端切口GCCTAGGATCCG+粘端切口HindⅡGTCGACCAGCTG平或钝末端（bluntend)粘性末端（stickyend)切口：平端切口、粘端切口*14BamHⅠGGATCCGTCGAC+平端切口GGATCC+GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ2.同裂酶来源不同但能识别相同序列，切割DNA后产生相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶。*15GGATCCGGATCC+BamHⅠGGATCCGGATCBamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA3.同尾酶识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端(compatibleend)。*16BamHⅠBglⅡGGATCCAGATCTGGAT4.可变酶识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个核苷酸。为Ⅱ型限制酶的特例。

如：BstpⅠGGTNACC

CCANTGG*17

如：BblⅠCGGN(N)4CCG;

GCC(N)4NGGC4.可变酶如：BstpⅠ（四）限制酶的应用及影响因素1.限制酶的应用重组DNA技术、基因组DNA物理图谱绘制、基因组DNA同源性研究、切割基因组DNA或cDNA构建基因组文库或cDNA文库等。2.影响限制酶作用的因素

DNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、时间及缓冲液体系等。*18（四）限制酶的应用及影响因素1.限制酶的应用2.影响限制

只能封闭DNA链上的缺口（nick）,而不能封闭裂口（gap）。

是一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。二、DNA连接酶(DNAligase)——基因工程的缝纫针----“接”需要在一条DNA链的3末端具有游离的羟基、另一条DNA链的5末端有磷酸基团，而且反应过程需要由ATP提供能量。*19只能封闭DNA链上的缺口（nick）,而不能封闭裂1.T4DNA连接酶

连接的底物可以是两个双链DNA分子的互补黏性末端或平末端。最早是从T4噬菌体感染的大肠埃希菌分离，易制备，应用广。（一）DNA连接酶的类型：2.大肠埃希菌DNA连接酶只能连接具有互补黏性末端的两个双链DNA分子底物。需要NAD+作为辅助因子。*201.T4DNA连接酶连接的底物可以是两个双链DNA连接黏性末端作用模式图：*******GAATTC*****************CTTAAG**********5′3′5′3′EcoRIDNA连接酶*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′—P

OH—+*21连接黏性末端作用模式图：*******GAATTC*****连接平末端作用模式图：*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′AluIT4DNA连接酶—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************+*22连接平末端作用模式图：*************AGCT*1.DNA连接酶应用（二）DNA连接酶的应用及影响因素：催化两个具有黏性末端或平末端的DNA片段形成磷酸二酯键，形成新的重组DNA分子；接合由复制叉上不连续复制链上产生的缺口；缝合DNA损伤修复、遗传重组及DNA链剪接中缺口。*231.DNA连接酶应用（二）DNA连接酶的应用及影响因素2.影响DNA连接酶作用的因素①对黏性末端的连接效率远高于对平末端的连接；*24②连接黏性末端的温度一般在4~15℃；③连接酶的用量，平末端连接用量高；④ATP浓度一般为0.01~1mmol/L;⑤载体分子与插入片段的摩尔数比为1:10~1:3。2.影响DNA连接酶作用的因素①对黏性末端的连接效率远高三、DNA聚合酶能够催化以DNA或RNA为模板合成DNA的反应，把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子或引物链的3´-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。（一）大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ（二）Klenow片段具有53聚合酶，

53及35核酸外切酶活性。具有53聚合酶，

35核酸外切酶活性。*25三、DNA聚合酶能够催化以DNA或RNA为模板（三）TaqDNA聚合酶（四）反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶。具有53聚合酶，53核酸外切酶活性，对Mg2+浓度非常敏感。是第一个被发现的、耐热的、依赖DNA的DNA聚合酶，

最佳反应温度为70~75℃。

普遍使用的是来源于AMV(鸟类成髓细胞白血病病毒)及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)的反转录酶，具有53聚合酶。*26（三）TaqDNA聚合酶（四）反转录酶：依赖RNA的DN（一）末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）

四、其它修饰酶是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。(1)底物是单链DNA或有3′突出末端的双链DNA。5′3′OHCo2+dNTPnppi5′3′(A/G/C/T)n*27（一）末端脱氧核苷酸转移酶四、其它修饰酶是一种(2)底物是3’平端或3’凹端的双链DNA。Co2+dNTPnppi5′3′OH5′3′(A/G/C/T)nCo2+dNTPnppi5′3′OH5′3′(A/G/C/T)n用途：

（1）主要作用是在载体或目的基因3’末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重组。（2）DNA3’末端的同位素标记。*28(2)底物是3’平端或3’凹端的双链DNA。Co2+dNT（二）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5’-磷酸基团。（三）多核苷酸激酶（polynuleotidekinase）又称T4多核苷酸激酶，能催化ATP的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA片段的5’-OH末端。*29（二）碱性磷酸酶能特异地切除DNA、RNA和dNTP重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻5´磷酸和3´羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①缺口合成；②双链cDNA分子或片段连接；③平移制作高比活探针；④DNA序列分析；⑤填补3´末端Klenow片段DNA聚合酶I大片段，具有DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记反转录酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功第三节

重组DNA技术中常用载体

CommonVectorsinRecombinant

DNATechnology*31第三节

重组DNA技术中常用载体

CommonVect载体（vector）的概念克隆载体(cloningvector)表达载体(expressionvector)可使插入的外源DNA片段被转录、翻译成多肽链的载体。是在克隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相适应的强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。含有复制起始点oriC，可使插入的外源DNA序列被扩增或保存的载体。指能携带外源DNA分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具。应具备的基本条件：*32载体（vector）的概念克隆载体(cloningvec①含有复制起始点，具有自主复制的能力；⑥具有较高的遗传稳定性。⑤拷贝数较多，易于与受体细胞的染色体DNA分开；④分子质量相对较小，以容纳较大的外源DNA；③具有一个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；②具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；载体应具备的基本条件：*33①含有复制起始点，具有自主复制的能力；⑥具有较高的遗传稳重组DNA技术中常用载体：一、质粒载体：最常用的目的基因克隆载体粘粒载体：用于克隆大片段DNA(自习)M13噬菌体载体：用于Sanger双脱氧DNA测序(自习)二、噬菌体载体：构建基因组DNA或cDNA文库(自习)四、病毒载体：包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物病

毒用于在真核细胞中表达目的蛋白(自习)三、人工染色体载体：用于更大DNA片段的克隆(自习)*34重组DNA技术中常用载体：一、质粒载体：最常用的目的基因克隆一、质粒(plasmid)载体细菌培养

质粒存在于细菌染色质以外，具有自我复制能力的双链环状DNA。小的约2~3kb,大的数百kb。大肠杆菌染色质质粒质粒扩增并表达蛋白质

严紧型质粒（stringentplaxmid）

松弛型质粒（relaxedplaxmid）一、质粒(plasmid)载体细菌培养质粒存在AmprORITetr（一）pBR322质粒：一种克隆质粒ORI：Ampr,

Tetr：两个抗性基因，用于筛选阳性克隆。PstI,BamHI：两个酶切位点，用于插入目的基因分子量较小拷贝数较高复制起始点，保证高拷贝自我复制。*36目的基因与pBR322经BamHI酶切后重组如何筛选得到阳性克隆？AmprORITetr（一）pBR322质粒：一种克隆质粒O克隆3,5,7,9,10是阳性克隆TetTet平板123456789101112123456789101112Amp*37克隆3,5,7,9,10是阳性克隆TetTet平板1234阳性克隆*38AmpTet阳性克隆*38AmpTetDNA连接酶重组质粒目的基因AmprTetrPstI目的基因与pBR322经PstI酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？课堂讨论*39用PstI酶切DNA连接酶重组质粒目的基因AmprTetrPstI

（二）pUC质粒载体系列OripUC192686bpAmprP(BLA)PlacAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCS提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ’蓝白斑筛选阳性克隆分子量更小拷贝数更高*40（二）pUC质粒载体系列OripUC192686bpApUC质粒载体插入了β半乳糖苷酶N端α肽片段的编码基因lacZ’；产物α肽也无活性，也不能分解培养基中的X-gal。蓝白斑筛选

DH5a宿主菌染色体插入了β半乳糖苷酶C端的ω肽片段的编码基因lac’△M15；产物ω肽无活性；不能分解培养基中的X-gal。有活性的β半乳糖苷酶由α肽和ω肽互补(α互补)而成，可使培养基中的X-gal分解形成蓝色化合物而出现蓝色菌落。*41pUC质粒载体插入了β半乳糖苷酶N端α肽片段的编码基α*42X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶（α+ω）白色蓝白斑筛选：ωDH5a宿主菌α*42X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶（α+ω）白蓝色菌落：阴性克隆;

白色菌落：阳性克隆*43蓝白斑筛选思考题3蓝色菌落：阴性克隆;白色菌落：阳性克隆*43蓝（三）其它质粒载体1.能在体外转录克隆基因的质粒载体由pUC系列质粒载体派生而来，带有来自噬菌体T7、SP6的启动子，为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。如pGEM-3Z/4Z.2.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是一类人工构建的，具有两种不同复制起始点和选择标记，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。*44（三）其它质粒载体1.能在体外转录克隆基因的质粒载体（四）TA克隆载体

许多耐热的DNA聚合酶(如Taq、Tth等)扩增时，都在PCR产物3’-末端加上了A碱基。是专为克隆PCR产物而设计的，在其MCS两侧的3´-末端携带有未配对的T碱基的载体。3′3′5′PCR产物AA5′Taq酶T载体TT5′5′3′3′*45在连接酶的作用下可直接将PCR产物克隆到TA载体中。（四）TA克隆载体许多耐热的DNA聚合酶(如Taq二、噬菌体载体（自习）噬菌体(bacteriophage,phage)

是一类细菌病毒，可用于克隆和扩增特定的DNA片段，是广泛使用的基因克隆载体。野生λ噬菌体的基因组为线状双链DNA，两端为12bp彼此完全互补，称之为cos位点的5’-单链突出黏性末端；进入宿主细胞后形成坏状双链结构，按θ方式及滚环方式进行复制。感染细菌后，可进入溶菌生命周期及溶源生命周期。*46二、噬菌体载体（自习）噬菌体(bacteriophageλgt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆)EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建)可容纳7kb以下的外源片段。λgt10和λgt11分别在阻遏剂λCI基因和lacZ’基因上，有供外源基因片段插入的单一内切酶位点。可容纳9~23kb的外源片段。具有两个或两组内切酶位点，经酶切除去基因组中噬菌体正常生长非必需的序列，由外源基因片段取代。（一）λ噬菌体载体可插入的外源DNA片段大，感染效率远高于质粒载体的转化效率。*47λgt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆)EMBLEMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建)EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建)λgt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆)λgt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆)黏粒载体结构特点：④分子小，可插入45kb的外源DNA片段；②含质粒自主复制成分ORI，和耐药基因Ampr；③含带有一个或多个单一酶切位点的多聚物接头；①含噬菌体cos黏性末端及与包装有关的短序列；（二）黏粒载体

粘粒又称柯斯质粒(cossite-carryingplasmid,cosmid),是由噬菌体的cos黏性末端和细菌的质粒构建而成。⑤接上在真核细胞生活的元件，如SV40复制区及启

动子，可作为穿梭载体。*50黏粒载体结构特点：④分子小，可插入45kb的外源DNA片*51*51（三）M13噬菌体载体

M13噬菌体基因组为闭环单链DNA，感染雄性大肠埃希菌后，在菌体内复制成相当于质粒的复制型（RF）M13双链DNA，可用作基因克隆载体。M13mp系列(携带有含MCS序列的lacZ’基因),外源DNA不宜大于1500bp。pBluescriptKS（+/-）是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体。

当RF型M13在细菌内达到100~200个拷贝后，M13只合成单链DNA，并包装成噬菌体颗粒分泌到细胞外。可用于DNA测序、体外定点突变和核酸杂交。*52（三）M13噬菌体载体M13噬菌体基因组为闭环单

pBluescriptSK（+/-）噬菌粒载体的分子结构示意图。SK表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向转录；（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。

pBluescriptSK（+/-）噬菌粒载体的分子结三、人工染色体载体（自习）

酵母人工染色体载体，简称YAC载体，由酵母染色体、酵母2μmDNA质粒的复制起始序列等元件衍生而成；可插入100kb～2,000kb外源DNA片段，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。

细菌人工染色体载体，简称BAC载体，以细菌F因子为基础构建而成；可插入100kb～300kb外源DNA片段，是人类基因组计划中序列分析采用的主要载体。*54三、人工染色体载体（自习）酵母人工染色体载体YAC结构图及基因克隆过程*55YAC结构图及基因克隆过程*55常用于构建载体的RNA病毒（整合型）：逆转录病毒(retrovirus,RV)慢病毒(lentivirus):也属于RV家族常用于构建载体的DNA病毒（游离型）：腺病毒(adenovirus,Ad)腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)痘苗病毒(vacciniavirus)四、病毒载体（自习）

*56常用于构建载体的RNA病毒（整合型）：逆转录病毒(retro第四节

目的基因的获得和体外重组

TargetDNAAcquirementand

RecombinantInVitro*57第四节

目的基因的获得和体外重组

TargetDNAA一、目的基因的获取—分（一）化学合成法要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。（二）PCR或RT-PCR要求已知目的基因的全序列或基因片段两侧的DNA序列。（三）从基因组文库中筛选

DNA文库(genomicDNAlibrary)

cDNA文库(cDNAlibrary)*58思考题4一、目的基因的获取—分（一）化学合成法（二）PCR或R（一）化学合成法*已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。*59**避免使用稀缺密码子，及宿主细胞的密码偏好。（一）化学合成法*已知氨基酸序列推测可能的DNA序列反转录AAnATTnT5′5′mRNA反转录酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1双链cDNA3′5′3′5′5′加热变性加入特异性引物DNA聚合酶重复上述步骤扩增出大量的产物聚合酶链式反应退火延伸（二）PCR或RT－PCR反转录AAnATTnT5′5′mRNA反转录酶mRNAc组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组DNA分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有gDNA的集合。1.gDNA文库构建（三）从基因文库中筛选*61EMBL3/4系列噬菌体载体(置换型，适用于基因组DNA文库构建)组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组D限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段gDNA文库EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建)*62限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscmRNAcDNA双链cDNA重组cDNA分子反转录酶载体受体菌复制2.cDNA文库的构建cDNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有cDNA的集合。*63含重组cDNA分子的转化菌λgt10/11系列噬菌体载体(插入型，适用于cDNA文库构建)mRNAcDNA双链cDNA重组cDNA分子限制酶切位点限制酶消化cosLRcoscosL左臂Rcos右臂限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~7KbDNA片段cosLRcos~7Kb外源cDNA片段cDNA文库λgt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆)cDNA片段*64限制酶切位点限制酶消化cosLRcoscosLRgDNA文库：g-文库cDNA文库：c-文库方法：

用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。3.从基因文库中筛选目的基因*65gDNA文库：g-文库cDNA文库：c-文库方法：用Screeningagenomiclibrarybycolonyhybridization.ScreeningagenomiclibrarybyBamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶，15ºC+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体目的基因自连载体自连二、目的基因的体外重组—接（一）黏性末端连接1.同一限制酶切位点连BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶，15ºEcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶，15ºC重组体2.不同限制酶切位点连*68EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶，15ºC重组体载体自连目的基因自连（二）平末端连接

*69目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶，15EcoRⅠCCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

(三）人工接头(linker)连接*70EcoRⅠCCGAATTCG5´-EcoRⅠ由平端加上5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nTT(T)nT3´5´5´

3´3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体3´A(A)nA

A(A)nA3´5´5´（四）同聚物加尾连接*715´3´载体DNA5´3´目的基因限制酶或机械剪切限制酶PCR扩增+3′3′5′PCR产物AA5′T载体TT5′5′3′3′连接转化蓝白筛选Taq酶(五）T-A克隆*72PCR扩增+3′3′5′PCR产物AA5′T载体TT5′5′*73Inporting,ScreeningandVerificationofRecombinantDNA第五节

重组DNA分子的导入和筛选与鉴定*73Inporting,ScreeningandVe一、重组DNA分子的导入—转宿主细胞应具备的特征：①处于感受态②对载体无严格限制③限制酶和重组酶缺陷④不对外源DNA进行修饰⑤能表达重组体所提供表型特征将体外构建的重组DNA分子导入用于复制、扩增和表达的原核或真核受体细胞。*74一、重组DNA分子的导入—转宿主细胞应具备的特征：①（一）转化(transformation)

指将质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌（原核细胞）的过程。如大肠杆菌K12突变株低渗CaCl2,0℃处理进入感受态。（二）转染(transfection)

指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组DNA分子导入真核细胞的过程。（三）感染(infection)

指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后，通过感染宿主细胞而借助外壳蛋白将重组DNA注入到细菌或真核细胞内复制扩增的过程。*75（一）转化(transformation)（二）转染(tra1.磷酸钙介导的转染2.DEAE-葡聚糖介导的转染3.电穿孔转染4.脂质体转染5.显微注射（二）转染(transfection)*76思考题51.磷酸钙介导的转染（二）转染*76思考题5非转化子(不能生长）单抗生素筛选转化子阳性重组子自身环化载体未酶解完全载体非目的基因插入载体1.根据载体的耐药性标记（初步）筛选（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选二、重组DNA分子的筛选与鉴定—筛*77非转化子(不能生长）单抗生素筛选转化子阳性重组子1.根据载2.根据载体的耐药性标记插入失活选择例：载体中的Tetr基因被目的基因插入而失去活性，不能表达抗Tet蛋白，故细菌不能在含Tet的培养基中存活。*782.根据载体的耐药性标记插入失活选择例：载体中的Tetr基因Atypicalbacterialtransformationexperiment.Atypicalbacterialtransforma

α互补的检测3.根据β-半乳糖苷酶显色反应筛选α互补的检测3.根据β-半乳糖苷酶显色反应筛选组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救4.根据筛选插入的外源基因的性状进行筛选*81λ-核酸外切酶组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷促进组氨酸(二)限制性内切酶酶切电泳鉴定(四)PCR(三)核酸分子杂交法

是从基因文库中挑选含有目的基因的阳性克隆的常用方法。

根据MCS两侧的保守序列设计引物，对提取的重组载体进行PCR扩增鉴定，并可直接进行测序。*82(五)免疫化学检测法利用特异性抗体与目的基因表达的蛋白质相互结合通过放射免疫、化学发光来筛选转化菌。

用插入点的限制酶酶切重组DNA，行琼脂糖凝胶电泳，根据是不有目的基因和载体的泳带来判断重组成功与否。(二)限制性内切酶酶切电泳鉴定(四)PCR(三)核酸分重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）gDNA文库cDNA化学合成RT-PCR限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化、转染、感染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定核酸分子杂交法*83重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源*84ExogenousGeneExpression第六节

外源基因的表达*84ExogenousGeneExpression第六表达体系的建立包括：

外源基因表达涉及目的基因的克隆、扩增，转录、翻译，蛋白质产物的加工修饰，以及分离、纯化等过程，需要在适合的表达系统中完成。表达系统可根据受体细胞的不同分为原核表达系统和真核表达系统。*85思考题6表达载体的构建；

受体细胞的建立；

表达产物的分离、纯化等技术和策略。表达体系的建立包括：外源基因表达涉及目的基因的克隆、产品功能组织型纤溶酶原激活物抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激红细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱

重组DNA医药产品产品功能组织型纤溶酶原激活物抗凝血液因子VI一、外源基因在原核系统中的表达

----大肠杆菌（E.coli）表达体系最常用优点:*87（一）优缺点培养简单、迅速、经济而又适合大规模生产。①只适于表达克隆的cDNA，不适于真核基因组DNA；

②真核蛋白常不能形成正确的折叠和修饰；③真核蛋白常以无生物活性的包含体形式存在；④难以实现大量分泌性蛋白的表达；⑤真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解；⑥原核细胞周质中常含有种类繁多的内毒素。缺点:一、外源基因在原核系统中的表达----大肠杆菌（（二）对外源目的基因的要求①外源真核基因不能带有5´端非编码区和内含子结

构，必须用cDNA或化学合成基因；②外源基因必须置于原核细胞的强启动子和SD序列

等元件控制下；③重组载体必须形成正确的开放阅读框架；④外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并能被有

效翻译，所表达的蛋白质产物稳定且对宿主菌不能有毒害作用。*88（二）对外源目的基因的要求①外源真核基因不能带有5´端非（三）对原核表达载体的要求①具有强启动子及其两侧的调控序列，能调控基

因的转录，产生大量mRNA；②含有SD序列，而且S