DNA分子标记用于中药鉴定课件

DNA分子标记用于中药鉴定2022/12/17DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定2022/12/16DNA分子标记1分子生药学molecularpharmacognosy在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学，所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法，是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。DNA分子标记用于中药鉴定分子生药学molecularpharmacognosy在分2分子生药学研究内容研究内容鉴定方面生产方面获取有效成分方面DNA分子标记鉴别药材培育选种转基因器官培养技术DNA分子标记用于中药鉴定分子生药学研究内容研究内容鉴定方面生产方面获取有效成分方面D3DNA分子遗传标记以形态学为主的生药鉴定方法(性状鉴别、显微鉴别)和理化鉴别，还不能解决所有生药的真实性鉴定问题，特别是对同属多来源生药及种内的一些变异(道地药材)、动物药等难以专属性地鉴定。学科发展的需要以及分子生物学技术的飞速发展使DNA分子遗传标记（DNAmoleculargeneticmarker）鉴别生药应运而生。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子遗传标记以形态学为主的生药鉴定方法(性状鉴别、显微4道地药材道地药材的形成是基因型与环境之间相互作用的产物，可用公式表示：表现型phenotype=基因型genotype+环境饰变（environmentalmodification）DNA分子标记用于中药鉴定道地药材道地药材的形成是基因型与环境之间相互作用的产物，可用5生药DNA分子遗传标记鉴定是指通过比较生药间DNA分子遗传多样性差异来鉴别生药基源，确定其学名的方法。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定6DNA分子是由G、A、C、T四种碱基构成，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，这就是生物的遗传多样(geneticdiversity)。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子是由G、A、C、T四种碱基构成，7在DNA分子上，有编码与物种存活密切相关的基因区域、编码与物种存活不十分密切相关的基因区域和非编码基因区域。基因组DNA的这些不同区域在生物进化过程中所受到的选择压力不同，前者所受选择压力大，表现出高度保守，后者所受选择压力小，表现出较大的变异。DNA分子标记用于中药鉴定在DNA分子上，有编码与物种存活密切相关的基因区域、编码8正是由于这种DNA分子不同区域承受的选择压力不同，使得DNA分子的不同区域有不同程度的遗传多样性。因此，我们能够选择适当的DNA分子遗传标记，在属、种、亚种、居群或个体水平上对研究对象进行准确地鉴别。下面对生药DNA分子遗传标记鉴定的相关技术和方法作一简单介绍。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定9一、DNA提取技术

DNA的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。总DNA的有效提取要求材料中的DNA尽可能少的降解。DNA分子标记用于中药鉴定一、DNA提取技术DNA的提取是现代生物技术进行中药鉴别10DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定11从植物药材中提取DNA一般可分为两个阶段:第一阶段是植物细胞破裂后释放出DNA。第二阶段是DNA与其它细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离，在这个阶段，重要的是要保证大量的DNA不能混杂在细胞碎片中，DNA要与蛋白质和其它污染物完全分离，因为这些污染物的存在会干扰下一步的分析。DNA分子标记用于中药鉴定从植物药材中提取DNA一般可分为两个阶段:DNA分子标记12对于幼嫩器官的材料（鲜品或硅胶快速干燥样品），一般方法都可以得到质量符合要求的DNA。但对于中药材，情况则要复杂得多，需要针对具体材料，设计去除含酚羟基的化合物和多糖类化合物的方法。DNA分子标记用于中药鉴定对于幼嫩器官的材料（鲜品或硅胶快速干燥样品），一般方法都可以13DNA的质量将直接关系到实验的成败。一般而言，所得的DNA应完整、有足够的量，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型，此外，还应满足下游操作的要求，如用于PCR分析的DNA不应含干扰PCR反应的污染物。DNA分子标记用于中药鉴定DNA的质量将直接关系到实验的成败。DNA分子标记用于中药14DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定15二、琼脂糖凝胶电泳技术

琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的常用方法，具有简便、快速的优点。DNA琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动

DNA分子标记用于中药鉴定二、琼脂糖凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定D16DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，使分子大小和构象不同的DNA分子迁移率出现较大差异，从而达到分离目的。在凝胶中加入少量溴化乙锭，其分子可插入DNA的碱基之间，因此可在紫外光灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置，并可在紫外光灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还17DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定18DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定19DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定20DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定21三、PCR技术

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术。DNA分子标记用于中药鉴定三、PCR技术聚合酶链式反应(polymerasech22DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定23PCR技术能在一个离心管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，在EB染色及电泳后，肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。DNA分子标记用于中药鉴定PCR技术能在一个离心管内将所要研究的目的基因或某一DN24DNA复制特点DNA分子标记用于中药鉴定DNA复制特点DNA分子标记用于中药鉴定25DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定26DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定27DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定281.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮循环作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；DNA分子标记用于中药鉴定1.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程29③引物的延伸DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。DNA分子标记用于中药鉴定③引物的延伸DNA模板-引物结合物在Taq302.参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。（1）引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。DNA分子标记用于中药鉴定2.参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dN31（2）酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100μl时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。DNA分子标记用于中药鉴定（2）酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应32（3）dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。DNA分子标记用于中药鉴定（3）dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和33在PCR反应中，dNTP的浓度应为50～200μmol/L，尤其应注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低还会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。DNA分子标记用于中药鉴定在PCR反应中，dNTP的浓度应为50～20034（4）模板(靶基因)质量是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或酚/SDS法等，要防止RNase降解RNA。DNA分子标记用于中药鉴定（4）模板(靶基因)质量是PCR成败与否35（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。DNA分子标记用于中药鉴定（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增36四、生药鉴定常用的DNA分子标记方法

DNA分子标记技术⒈以传统的southern杂交为基础的分子标记技术RFLP限制性内切酶片段长度多态性⒉以PCR为基础的分子标记技术⑴RAPD随机扩增多态性DNA⑵SCAR测序的扩增区段⑶STS测序的标记位点⑷DAFDNA扩增产物指纹分析DNA分子标记用于中药鉴定四、生药鉴定常用的DNA分子标记方法DNA分子标记技术DN37⒊以PCR和RFLP相结合的分子标记技术：AFLP扩增的限制性内切酶片段长度多态性⒋以重复序列为基础的分子标记技术⑴Satellite:卫星DNA(重复单位为几百～几千碱基对)⑵Microsatellite:微卫星DNA(重复单位为2～5碱基对)⑶SSR：短重复序列DNA分子标记用于中药鉴定⒊以PCR和RFLP相结合的分子标记技术：AFLP扩增的限38（一）限制性片段长度多态（restrictionfragmentlengthpolymorphism，简称RFLP）生物在进化过程中，由于种种原因引起的基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，在一处或几处发生某种差异，当这种改变（即使是很小的改变）涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，即限制性酶谱的条带方式将出现不同，产生多态性，称为限制性片段长度多态。DNA分子标记用于中药鉴定（一）限制性片段长度多态（restrictionfrag39一般应用Southern杂交检测这种多态性，将琼脂糖凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜（或其它膜）上，然后再用标记的克隆基因作探针进行杂交，经放射自显影后即可在X光片上看到DNA多态性了。该方法试验步骤繁琐（包括Southern转移、探针标记、杂交、检测等），又受到探针来源的限制，所需DNA样品量大（因没有对DNA进行扩增），仅适于DNA未明显降解的新鲜材料。DNA分子标记用于中药鉴定一般应用Southern杂交检测这种多态性，将琼脂糖凝胶40（二）随机扩增多态性DNA(RAPD)（randomamplifiedpolymorphicDNA）和任意引物PCR(AP-PCR)（arbitraryprimerPCR）RAPD（randomamplifiedpolymorphicDNA）是1990年美国杜邦公司科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.Welsh领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。Williams称之为RAPD，Welsh称之为AP-PCR。DNA分子标记用于中药鉴定（二）随机扩增多态性DNA(RAPD)（random41RAPD技术建立在PCR技术基础上，它是以任意序列的寡核苷酸单链(通常为10个碱基，AP-PCR则为20～30个碱基)为引物，对所研究的基因组DNA进行随机扩增。RAPD所用的一系列引物的DNA序列各不相同，但对于任一引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点。DNA分子标记用于中药鉴定RAPD技术建立在PCR技术基础上，它是以任意序列的寡42这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增的反应条件，即在一定范围内模板DNA上有与引物互补的反相重复序列时，就可扩增出此范围的DNA片段。在不同物种基因组DNA中，这种反相重复序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定的结合位点分布发生相应的变化，而使PCR扩增产物增加、减少或发生分子量的变化。通过对PCR产物的检测和比较，即可识别这些物种基因组DNA的多态片段。DNA分子标记用于中药鉴定这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩43与常规PCR相比，RAPD主要有以下特点：①无需专门设计RAPD扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9～10个寡核苷酸。②每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。

DNA分子标记用于中药鉴定与常规PCR相比，RAPD主要有以下特点：DNA分44③退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。④较之常规PCR，RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量DNA分子标记，可以借助计算机进行系统分析。DNA分子标记用于中药鉴定③退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引45该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物、微生物物种及中药材的鉴定等各个领域。在生药鉴定方面，该方法在人参及其伪品、甘草、黄连、冬虫夏草及其伪品、贝母等药材的鉴定中有应用。DNA分子标记用于中药鉴定该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物46（三）扩增片段长度多态性标记（amplifiedfragmentlengthpolymorphicDNAmarker，AFLP）AFLP标记是RFLP与RAPD相结合的产物，是1992年由荷兰Keygene公司科学家VosPieter等发明并发展起来的一种选择性扩增限制性酶切片段的方法。AFLP检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段间DNA序列的插入与缺失，本质上与RFLP一致。DNA分子标记用于中药鉴定（三）扩增片段长度多态性标记（amplifiedfrag47AFLP的优越性：①AFLP可在不知基因组DNA序列情况下构建其指纹图谱。②AFLP所需DNA用量少。③AFLP反应灵敏、快速高效。④AFLP指纹图谱多态性丰富，可用来检测种和种以下水平的差异。⑤AFLP标记呈典型的孟德尔遗传，能检测到整个基因组的遗传变异。⑥AFLP对反映条件的变化如模板浓度变化等不灵敏，重复性好。⑦AFLP采用的是与接头序列和限制性内切酶位点同源的特异引物，且采用了较高的退火温度，特异性较高。

DNA分子标记用于中药鉴定AFLP的优越性：①AFLP可在不知基因组DNA序48正是由于该技术具有以上优点，在遗传多样性、基因追踪及定位、分类与进化、系统发育、品种鉴定等基因组研究的几乎所有领域都得到了广泛的应用。其不足之处是所需仪器和试剂价格昂贵，试验成本较高。另外检测过程中如果使用放射性同位素，会对环境和人身安全构成一定的危害。DNA分子标记用于中药鉴定正是由于该技术具有以上优点，在遗传多样性、基因追踪及定位、分49（四）DNA测序法和基于DNA序列测定的PCR-RFLP、特异引物PCR方法基于PCR技术的DNA直接测序技术是以PCR扩增引物作为测序引物，采用循环测序法对PCR扩增的双链DNA进行直接测序。PCR扩增所需要的基本条件是引物所覆盖区域的DNA序列必须是已知的，以便根据其序列来设计引物，也就是说需要预先知道靶基因的序列信息。DNA分子标记用于中药鉴定（四）DNA测序法和基于DNA序列测定的PCR-R50由于生药的遗传信息缺乏，应用DNA测序法鉴定中药，一般是选择合适的目的基因，根据其保守区的序列设计通用引物，使其在靶基因保守区识别并扩增，这样可以对不同分类等级生物类群的DNA进行扩增，而不需要预先知道靶基因的序列信息，使应用DNA测序法鉴别生药成为可能。DNA分子标记用于中药鉴定由于生药的遗传信息缺乏，应用DNA测序法鉴定中药，一般是51生药的DNA测序鉴定就是运用DNA测序技术建立正品药材及相关混伪品的原动植物的基因序列数据库，用同样的方法对待检测样品进行测序，对照数据库即可鉴定出中药材的真伪。该方法重现性好，鉴定结果准确可靠。但是，实际应用中，采用全序列比对的方法比较麻烦，为此又在序列测定的基础上发展了更加简便的PCR扩增的特定片段的限制性位点分析（PCR-RFLP）和位点特异性鉴别PCR方法（diagnosticPCR）。DNA分子标记用于中药鉴定生药的DNA测序鉴定就是运用DNA测序技术建立正品药52PCR-RFLP是在PCR和DNA序列分析基础上产生的RFLP技术。该方法是通过PCR扩增一段DNA片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，可得到有种属特异性的电泳谱带，从而达到品种鉴定的目的。例如该方法在贝母类、人参类和术类药材鉴定中应用。DNA分子标记用于中药鉴定PCR-RFLP是在PCR和DNA序列分析基础上产53自DeSalleR,BirsteinVJ1996年在Nature上发表了利用人工设计的引物鉴别鱼子酱中鱼卵所属鲟鱼的种类后，鉴别性PCR不断得到推广和应用。位点特异性鉴别PCR（diagnosticPCR）方法是根据正品及其混伪品特定区域的DNA序列数据，设计有高度特异性的正品药材的鉴别引物。DNA分子标记用于中药鉴定自DeSalleR,BirsteinVJ199654与通用引物不同的是，这对引物在PCR扩增时只能对来自正品的药材的DNA模板中的特定的区域进行有效扩增，而对来自混伪品或其它样品中该区域不能进行扩增。高特异性PCR鉴别反应条件与普通PCR基本一样，但在PCR循环中复性温度较高，一般在60℃左右。在这样的PCR条件下，如果引物设计合理，假阳性出现的概率非常之微。DNA分子标记用于中药鉴定与通用引物不同的是，这对引物在PCR扩增时只能对来自正品55当有样品鉴定时，从待鉴定的样品中提取少量DNA，以此为模板，用高特异性的鉴别引物在适当的条件下进行PCR扩增，PCR产物用0.8%~1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如为阳性，则为正品，否则为非正品药材，以此达到鉴别目的。高特异性鉴别引物设计所依据的DNA序列资料，可以通过对相关物种的DNA进行测序研究获得，也可以从GenBank或EMBL等DNA数据库中直接查得。例如该方法已在贝母类、石斛类、蛇类和龟甲类药材鉴定中应用。DNA分子标记用于中药鉴定当有样品鉴定时，从待鉴定的样品中提取少量DNA，以此为模56五、基因芯片技术

基因芯片（DNAchip），又称DNA微阵列(DNAmicroarray)。基因芯片技术是基于碱基互补原理，在固体表面按一定的阵列集成大量的基因探针，通过与待测基因进行杂交反应，进而对大量基因进行平行瞬时分析检测的技术。DNA分子标记用于中药鉴定五、基因芯片技术基因芯片（DNAchip），又称D57DNA芯片技术能够对微量样本中的核酸序列信息进行快速、高通量和低成本检测和分析，特别是其大通量并行化采集生物信息的特点，是目前其它分析技术无法相比的。DNA分子标记用于中药鉴定DNA芯片技术能够对微量样本中的核酸序列信息进行快速、高通58演讲完毕，谢谢听讲!再见，seeyouagain2022/12/17DNA分子标记用于中药鉴定演讲完毕，谢谢听讲!再见，seeyouagain202259DNA分子标记用于中药鉴定2022/12/17DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定2022/12/16DNA分子标记60分子生药学molecularpharmacognosy在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学，所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法，是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。DNA分子标记用于中药鉴定分子生药学molecularpharmacognosy在分61分子生药学研究内容研究内容鉴定方面生产方面获取有效成分方面DNA分子标记鉴别药材培育选种转基因器官培养技术DNA分子标记用于中药鉴定分子生药学研究内容研究内容鉴定方面生产方面获取有效成分方面D62DNA分子遗传标记以形态学为主的生药鉴定方法(性状鉴别、显微鉴别)和理化鉴别，还不能解决所有生药的真实性鉴定问题，特别是对同属多来源生药及种内的一些变异(道地药材)、动物药等难以专属性地鉴定。学科发展的需要以及分子生物学技术的飞速发展使DNA分子遗传标记（DNAmoleculargeneticmarker）鉴别生药应运而生。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子遗传标记以形态学为主的生药鉴定方法(性状鉴别、显微63道地药材道地药材的形成是基因型与环境之间相互作用的产物，可用公式表示：表现型phenotype=基因型genotype+环境饰变（environmentalmodification）DNA分子标记用于中药鉴定道地药材道地药材的形成是基因型与环境之间相互作用的产物，可用64生药DNA分子遗传标记鉴定是指通过比较生药间DNA分子遗传多样性差异来鉴别生药基源，确定其学名的方法。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定65DNA分子是由G、A、C、T四种碱基构成，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，这就是生物的遗传多样(geneticdiversity)。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子是由G、A、C、T四种碱基构成，66在DNA分子上，有编码与物种存活密切相关的基因区域、编码与物种存活不十分密切相关的基因区域和非编码基因区域。基因组DNA的这些不同区域在生物进化过程中所受到的选择压力不同，前者所受选择压力大，表现出高度保守，后者所受选择压力小，表现出较大的变异。DNA分子标记用于中药鉴定在DNA分子上，有编码与物种存活密切相关的基因区域、编码67正是由于这种DNA分子不同区域承受的选择压力不同，使得DNA分子的不同区域有不同程度的遗传多样性。因此，我们能够选择适当的DNA分子遗传标记，在属、种、亚种、居群或个体水平上对研究对象进行准确地鉴别。下面对生药DNA分子遗传标记鉴定的相关技术和方法作一简单介绍。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定68一、DNA提取技术

DNA的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。总DNA的有效提取要求材料中的DNA尽可能少的降解。DNA分子标记用于中药鉴定一、DNA提取技术DNA的提取是现代生物技术进行中药鉴别69DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定70从植物药材中提取DNA一般可分为两个阶段:第一阶段是植物细胞破裂后释放出DNA。第二阶段是DNA与其它细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离，在这个阶段，重要的是要保证大量的DNA不能混杂在细胞碎片中，DNA要与蛋白质和其它污染物完全分离，因为这些污染物的存在会干扰下一步的分析。DNA分子标记用于中药鉴定从植物药材中提取DNA一般可分为两个阶段:DNA分子标记71对于幼嫩器官的材料（鲜品或硅胶快速干燥样品），一般方法都可以得到质量符合要求的DNA。但对于中药材，情况则要复杂得多，需要针对具体材料，设计去除含酚羟基的化合物和多糖类化合物的方法。DNA分子标记用于中药鉴定对于幼嫩器官的材料（鲜品或硅胶快速干燥样品），一般方法都可以72DNA的质量将直接关系到实验的成败。一般而言，所得的DNA应完整、有足够的量，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型，此外，还应满足下游操作的要求，如用于PCR分析的DNA不应含干扰PCR反应的污染物。DNA分子标记用于中药鉴定DNA的质量将直接关系到实验的成败。DNA分子标记用于中药73DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定74二、琼脂糖凝胶电泳技术

琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的常用方法，具有简便、快速的优点。DNA琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动

DNA分子标记用于中药鉴定二、琼脂糖凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定D75DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，使分子大小和构象不同的DNA分子迁移率出现较大差异，从而达到分离目的。在凝胶中加入少量溴化乙锭，其分子可插入DNA的碱基之间，因此可在紫外光灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置，并可在紫外光灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还76DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定77DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定78DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定79DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定80三、PCR技术

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术。DNA分子标记用于中药鉴定三、PCR技术聚合酶链式反应(polymerasech81DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定82PCR技术能在一个离心管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，在EB染色及电泳后，肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。DNA分子标记用于中药鉴定PCR技术能在一个离心管内将所要研究的目的基因或某一DN83DNA复制特点DNA分子标记用于中药鉴定DNA复制特点DNA分子标记用于中药鉴定84DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定85DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定86DNA分子标记用于中药鉴定DNA分子标记用于中药鉴定871.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮循环作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；DNA分子标记用于中药鉴定1.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程88③引物的延伸DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。DNA分子标记用于中药鉴定③引物的延伸DNA模板-引物结合物在Taq892.参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。（1）引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。DNA分子标记用于中药鉴定2.参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dN90（2）酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100μl时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。DNA分子标记用于中药鉴定（2）酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应91（3）dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。DNA分子标记用于中药鉴定（3）dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和92在PCR反应中，dNTP的浓度应为50～200μmol/L，尤其应注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低还会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。DNA分子标记用于中药鉴定在PCR反应中，dNTP的浓度应为50～20093（4）模板(靶基因)质量是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或酚/SDS法等，要防止RNase降解RNA。DNA分子标记用于中药鉴定（4）模板(靶基因)质量是PCR成败与否94（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。DNA分子标记用于中药鉴定（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增95四、生药鉴定常用的DNA分子标记方法

DNA分子标记技术⒈以传统的southern杂交为基础的分子标记技术RFLP限制性内切酶片段长度多态性⒉以PCR为基础的分子标记技术⑴RAPD随机扩增多态性DNA⑵SCAR测序的扩增区段⑶STS测序的标记位点⑷DAFDNA扩增产物指纹分析DNA分子标记用于中药鉴定四、生药鉴定常用的DNA分子标记方法DNA分子标记技术DN96⒊以PCR和RFLP相结合的分子标记技术：AFLP扩增的限制性内切酶片段长度多态性⒋以重复序列为基础的分子标记技术⑴Satellite:卫星DNA(重复单位为几百～几千碱基对)⑵Microsatellite:微卫星DNA(重复单位为2～5碱基对)⑶SSR：短重复序列DNA分子标记用于中药鉴定⒊以PCR和RFLP相结合的分子标记技术：AFLP扩增的限97（一）限制性片段长度多态（restrictionfragmentlengthpolymorphism，简称RFLP）生物在进化过程中，由于种种原因引起的基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，在一处或几处发生某种差异，当这种改变（即使是很小的改变）涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，即限制性酶谱的条带方式将出现不同，产生多态性，称为限制性片段长度多态。DNA分子标记用于中药鉴定（一）限制性片段长度多态（restrictionfrag98一般应用Southern杂交检测这种多态性，将琼脂糖凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜（或其它膜）上，然后再用标记的克隆基因作探针进行杂交，经放射自显影后即可在X光片上看到DNA多态性了。该方法试验步骤繁琐（包括Southern转移、探针标记、杂交、检测等），又受到探针来源的限制，所需DNA样品量大（因没有对DNA进行扩增），仅适于DNA未明显降解的新鲜材料。DNA分子标记用于中药鉴定一般应用Southern杂交检测这种多态性，将琼脂糖凝胶99（二）随机扩增多态性DNA(RAPD)（randomamplifiedpolymorphicDNA）和任意引物PCR(AP-PCR)（arbitraryprimerPCR）RAPD（randomamplifiedpolymorphicDNA）是1990年美国杜邦公司科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.Welsh领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。Williams称之为RAPD，Welsh称之为AP-PCR。DNA分子标记用于中药鉴定（二）随机扩增多态性DNA(RAPD)（random100RAPD技术建立在PCR技术基础上，它是以任意序列的寡核苷酸单链(通常为10个碱基，AP-PCR则为20～30个碱基)为引物，对所研究的基因组DNA进行随机扩增。RAPD所用的一系列引物的DNA序列各不相同，但对于任一引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点。DNA分子标记用于中药鉴定RAPD技术建立在PCR技术基础上，它是以任意序列的寡101这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增的反应条件，即在一定范围内模板DNA上有与引物互补的反相重复序列时，就可扩增出此范围的DNA片段。在不同物种基因组DNA中，这种反相重复序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定的结合位点分布发生相应的变化，而使PCR扩增产物增加、减少或发生分子量的变化。通过对PCR产物的检测和比较，即可识别这些物种基因组DNA的多态片段。DNA分子标记用于中药鉴定这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩102与常规PCR相比，RAPD主要有以下特点：①无需专门设计RAPD扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9～10个寡核苷酸。②每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。

DNA分子标记用于中药鉴定与常规PCR相比，RAPD主要有以下特点：DNA分103③退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。④较之常规PCR，RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量DNA分子标记，可以借助计算机进行系统分析。DNA分子标记用于中药鉴定③退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引104该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物、微生物物种及中药材的鉴定等各个领域。在生药鉴定方面，该方法在人参及其伪品、甘草、黄连、冬虫夏草及其伪品、贝母等药材的鉴定中有应用。DNA分子标记用于中药鉴定该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物105（三）扩增片段长度多态性标记（amplifiedfragmentlengthpolymorphicDNAmarker，AFLP）AFLP标记是RFLP与RAPD相结合的产物，是1992年由荷兰Keygene公司科学家VosPieter等发明并发展起来的一种选择性扩增限制性酶切片段的方法。AFLP检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段间DNA序列的插入与缺失，本质上与RFLP一致。DNA分子标记用于中药鉴定（三）扩增片段长度多态性标记（amplifiedfrag106AFLP的优越性：①AFLP可在不知基因组DNA序列情况下构建其指纹图谱。②AFLP所需DNA用量少。③AFLP反应灵敏、快速高效。④AFLP指纹图谱多态性丰富，可用来检测种和种以下水平的差异。⑤AFLP标记呈典型的孟德尔遗传，能检测到整个基因组的遗传变异。⑥AFLP对反映条件的变化如模板浓度变化等不灵敏，重复性好。⑦AFLP采用的是与接头序列和限制性内切酶位点同源的特异引物，且采用了较高的退火温度，特异性较高。

DNA分子标记用于中药鉴定AFLP的优越性：①AFLP可在不知基因组DNA序107正是由于该技术具有以上优点，在遗传多样性、基因追踪及定位、分类与进化、系统发育、品种鉴定等基因组研究的几乎所有领域都得到了广泛的应用。其不足之处是所需仪器和试剂价格昂贵，试验成本较高。另外检测过程中如果使用放射性同位素，会对环境和人身安全构成一定的危害。DNA分子标记用于中药鉴定正是由于该技术具有以上优点，在遗传多样性、基因追踪及定位、分108（四）DN