最新九章节酶免疫技术课件

九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术1第二节酶免疫技术的分类一、均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理二、方法类型及反应原理思考题小结第二节酶免疫技术的分类思考题2最新九章节酶免疫技术课件3最新九章节酶免疫技术课件4最新九章节酶免疫技术课件5最新九章节酶免疫技术课件6最新九章节酶免疫技术课件7最新九章节酶免疫技术课件8碱性磷酸酶（AP）

菌源性AP肠粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫测定

常用酶酶和酶作用底物菌源性AP用于均相酶常用酶酶和酶作用底物9HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高

常用底物酶和酶作用底物HRP的底物DH2+H2O2→→→D+2H2OHR10HRP的常见底物

邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物酶和酶作用底物HRP的常见底物邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨11OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。

HRP的常见底物

酶和酶作用底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长49212AP的底物

β-Gal的底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。常用底物酶和酶作用底物AP的β-Gal对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮13酶免疫技术的核心组成部分

酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物

二、酶标记抗体或抗原酶免疫技术的核心组成部分酶结合物（conjugate）通过14抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。

制备方法要求酶标记抗体或抗原抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力15制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不形成聚合物酶标记抗体或抗原制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和16制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原

戊二醛交联法酶标记抗体或抗原制备方法过碘酸钠法（直接法）戊二醛交联法酶标记抗体或抗原17戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。

酶标记抗体或抗原戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋18纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度

常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、19固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法

固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面

三、固相载体固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分20要求

结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济种类塑料制品

微颗粒膜载体

固相载体要求结合抗体或抗原的容量大种类塑料制品固相载体21将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附包被coating封闭blocking包被与封闭将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～22

第二节酶免疫技术分类

第二节酶免疫技术分类

23酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位

液体标本中抗原或抗体的定性和定量酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相24用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定

酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理一、均相酶免疫测定用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定酶标记物与相应25最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供体免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫测定最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMIT克隆酶供体免疫26EMIT示意图EMIT示意图27CEDIA示意图CEDIA示意图28分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物二、非均相酶免疫测定分类：液相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物29

第三节酶联免疫吸附试验

第三节酶联免疫吸附试验

30底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理底物显色原理包被反应洗涤1234一、基本原理31固相的抗原或抗体

酶标记物（酶结合物）

酶反应的底物

三个必要试剂

二、方法类型及反应原理固相的抗原或抗体酶标记物（酶结合物）酶反应的底物三个必32双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：

二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原的方法双抗体夹心法ELISA检测抗原的方法33最新九章节酶免疫技术课件341、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加待检物4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包2、加待检物无抗3、加酶标抗体+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加待检物435竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的方法竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标36最新九章节酶免疫技术课件37洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYE38间接法方法

用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用

常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISA检测抗体的方法间接法ELISA检测抗体的方法39最新九章节酶免疫技术课件401、已知抗原吸2、加待检物3、加酶标抗Ig4、加酶作用的底物1、已知抗体吸2、加待检物3、加酶标的抗Ig4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+1、已知抗原吸2、加待检物3、加酶标抗Ig4、加酶作用的底物41双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体的方法双抗原夹心法ELISA检测抗体的方法42竞争法原理：类似检测抗原的竞争法

应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测ELISA检测抗体的方法竞争法ELISA检测抗体的方法43捕获法

应用：

病原体急性感染诊断中的IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体ELISA检测抗体的方法捕获法ELISA检测抗体的方法44捕获法

原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色

捕获法原理：45洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYY46

第四节酶免疫测定的应用

第四节酶免疫测定的应用

47均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定481．酶免疫技术的要点？2．酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？3．竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4．常用的底物有哪几类？特点？5．常用的酶有哪几类？特点？6．何谓包被与封闭？其作用？7．常用固相载体的种类和特点？8．举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。9．ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？10．对酶免疫技术的应用评价如何？思考题1．酶免疫技术的要点？思考题49酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。小结酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为50

结束语谢谢大家聆听！！！51

结束语谢谢大家聆听！！！51九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术52第二节酶免疫技术的分类一、均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理二、方法类型及反应原理思考题小结第二节酶免疫技术的分类思考题53最新九章节酶免疫技术课件54最新九章节酶免疫技术课件55最新九章节酶免疫技术课件56最新九章节酶免疫技术课件57最新九章节酶免疫技术课件58最新九章节酶免疫技术课件59碱性磷酸酶（AP）

菌源性AP肠粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫测定

常用酶酶和酶作用底物菌源性AP用于均相酶常用酶酶和酶作用底物60HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高

常用底物酶和酶作用底物HRP的底物DH2+H2O2→→→D+2H2OHR61HRP的常见底物

邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物酶和酶作用底物HRP的常见底物邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨62OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。

HRP的常见底物

酶和酶作用底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长49263AP的底物

β-Gal的底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。常用底物酶和酶作用底物AP的β-Gal对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮64酶免疫技术的核心组成部分

酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物

二、酶标记抗体或抗原酶免疫技术的核心组成部分酶结合物（conjugate）通过65抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。

制备方法要求酶标记抗体或抗原抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力66制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不形成聚合物酶标记抗体或抗原制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和67制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原

戊二醛交联法酶标记抗体或抗原制备方法过碘酸钠法（直接法）戊二醛交联法酶标记抗体或抗原68戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。

酶标记抗体或抗原戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋69纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度

常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、70固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法

固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面

三、固相载体固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分71要求

结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济种类塑料制品

微颗粒膜载体

固相载体要求结合抗体或抗原的容量大种类塑料制品固相载体72将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附包被coating封闭blocking包被与封闭将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～73

第二节酶免疫技术分类

第二节酶免疫技术分类

74酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位

液体标本中抗原或抗体的定性和定量酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相75用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定

酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理一、均相酶免疫测定用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定酶标记物与相应76最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供体免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫测定最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMIT克隆酶供体免疫77EMIT示意图EMIT示意图78CEDIA示意图CEDIA示意图79分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物二、非均相酶免疫测定分类：液相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物80

第三节酶联免疫吸附试验

第三节酶联免疫吸附试验

81底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理底物显色原理包被反应洗涤1234一、基本原理82固相的抗原或抗体

酶标记物（酶结合物）

酶反应的底物

三个必要试剂

二、方法类型及反应原理固相的抗原或抗体酶标记物（酶结合物）酶反应的底物三个必83双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：

二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原的方法双抗体夹心法ELISA检测抗原的方法84最新九章节酶免疫技术课件851、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加待检物4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包2、加待检物无抗3、加酶标抗体+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加待检物486竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的方法竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标87最新九章节酶免疫技术课件88洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYE89间接法方法

用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用

常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISA检测抗体的方法间接法ELISA检测抗体的方法90最新九章节酶免疫技术课件911、已知抗原吸2、加待检物3、加酶标抗Ig4、加酶作用的底物1、已知抗体吸2、加待检物3、加酶标的抗Ig4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+1、已知抗原吸2、加待检物3、加酶标抗Ig4、加酶作用的底物92双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体的方法双抗原夹心法ELISA检测抗体的方法93竞争法原理：类似检测抗原的竞争法

应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测ELISA检测抗体的方法竞争法ELISA检测抗体的方法94捕获法

应用：

病原体急性感染诊断中的IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体ELISA检测抗体的方法捕获法ELISA检测抗体的方法95捕获法

原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色

捕获法原理：96洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYY