ALK基因在肝细胞癌中的表达及临床意义

ALK基因在肝细胞癌中的表达及临床意义贾守薇;邵琼;吴小延;曹利;龙子君;邵建永;黄红兵目的：探讨间变性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphomakinase，ALK）基因在肝细胞癌（hepatocellularHCC）组织中的表达及其临床意义。方法采用荧光原位杂交法（fluorescentinsituhybridizaiISH）检测ALK213HCC213HCC中无ALK基因重排阳性，28ALK基因拷贝数增加（ALKgenecopynumbergain，ALK-CNG）现象。ALK-CNG 阳性表达与HCC患者年龄、性别、AJCC分期、Child-Pugh评分及复发情况均无明显相关（．05），HCC患者预后相关（．048），晚期患者中ALK-CNG阳性组与阴性组的无进展生存率差异有统计学意义（．007）。单变量和多Cox回归分析显示，ALK-CNGHCC患者的独立预后预测指标（0046）HCCALKALK基因拷贝数增加HCC患者预后的不良因素。%ObjectiveToexaminethestatusandclinicalsignificanceofanaplasticlymphomakinase(ALK)genealterationsinhepatocellularcarcinoma(HCC)patients.MethodsWedetectedALKgeneexpressioninHCCtissuesusingfluorescentinsituhybridization,andweassessedthecorrelationofALKgeneexpressionwithclinicopathologicoutcomesandprognosisinHCC.ResultsALKgenetranslocationwasnotobservedinanyHCCcasesinthepresentstudy.Incontrast,gaininALKgenecopynumber(ALK-CNG)wasdetectedin28HCCpatients,andthiscopynumbergaindidnotpositivelycorrelatewithage,sex,AJCCstage,recurrenceorChild-Pughclassification(P>0.05).CopynumbergaindidpositivelycorrelatewithpoorerprognosisinHCC(P=0.048),especiallyamongpatientswithstageⅢ/Ⅳdisease(P=0.007).UnivariateandmultivariateCoxproportionalhazardsregressionanalysissuggestedthatALK-CNGwasanindependentprognosticindicatorforpatientswithHCC(P=0.046).ConclusionALK-CNG,butnottranslocationofALK,ispresentinHCCandmaypredictunfavorableprognosis.【期刊名称】《中国癌症防治杂志》【年(卷),期】2016(008)006【总页数】6页(P354-359)【关键词】肝肿瘤;间变性淋巴瘤激酶(ALK);荧光原位杂交法;临床意义【作者】贾守薇;邵琼;吴小延;曹利;龙子君;邵建永;黄红兵【作者单位】510060510060;510060510060;510060510060510060510060;510060510060510060;510060510060心;510060510060510060【正文语种】中文【中图分类】R735.7肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是常见的恶性肿瘤，位居肿瘤相3［1］，90%以上的原发性肝癌为HCC，手术切除是重要30%～40%的患者有手术指征［2］HCC致死率仍较高［3-4］。多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼被批准用于治疗无法手术或远处转移的HCC［5-6］，HCC开启了新时代，而寻找预测治疗反应的生物标志物，筛选靶向治疗的优势人群成为分子靶向研究的重点。间变性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphomakinase，ALK）ALK基因包含了受体酪氨酸激酶的经典结构，即细胞外配体结合区、跨膜区及细胞内酪氨酸激酶区［7］ALK基因异常改变存在于多种肿瘤中，如非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）、间变性大细胞淋巴瘤、横纹肌肉瘤、炎症性肌纤维母细胞瘤、神经母细胞瘤等［8-9］。其异常形式主要包括基因融合、基因突变、基因扩增ALK基因能与NPM-、EML4-、TMP2-、KIF5B-ALK抑制剂克唑替尼在治疗NSCLC的临床研究中取得良好效果［10-12］，EML4-ALKNSCLC213HCC组织中ALK基因的表达情况，分析其与临床病理特征及预后的关系，以期为HCC的个体化治疗提供依据。临床资料1999120048213例HCCHCC，临床随访资料完整，临床分期采用国际抗癌联盟AJCC分期。剔除因其他疾病或意外死亡的患者。本研究经中山大学肿瘤防治中心伦理委员会同意。荧光原位杂交法3～5μm，65°C3h5min3；100%、85%、70%2min3minEDTA缓冲液20min，2×柠檬酸钠缓冲液）25minK，37°C20～25min10%中性福尔马林溶液固定10min，2×SSC25min70%、85%、100%3min7μL21混匀加到微量离心管，将探针混合物均匀2×SSC2×SSC/0.1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40）5min70%、85%、100%3min后取出，暗处自然干燥玻片。将DAPI复染液均匀滴加在杂交区域位置，荧光显微镜观察结果。ALK-FISH2SpectrumOrangeSpectrumGreen标记2ALKDNA片段，在激发光波长下分别呈红色ALK而成的黄色信号或互相靠在一起的红色和绿色荧光信号。当发生ALK基因断裂时，SpectrumOrange随ALK基因转位到其他染色体，两个探针分开，表现为分开的红色荧光信号和绿色荧光信号［13］。因此，ALK基因重排阳性结果指红色荧100个肿瘤细胞的组织样本，如有不小于15%的细胞出现上述阳性结果，则认为该样本检测ALK基因重排结果为阳性。ALK目前ALK基因拷贝数增加（ALKgenecopynumbergain，ALK-CNG）的阳性标准尚未建立，本研究通过构建受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristcROC）ALK-CNG4其敏感度、特异度和Youden's指数分别为35.6%、97.1%和0.327，由此确定4个拷贝数为ALKCNG 阳性的最佳临界点。本研究中一份计数不少于100个肿瘤胞的组织样本，如其中不少于40%的细胞出现红色荧光信号及绿色荧光信号均≥4个，即认为ALK-CNG 阳性。统计学处理SPSS13.0ALKχFisher精确概率检验，总生存期（overallsurvivlOS）为首次确诊至死亡或末次随访时间。无进展生存时间（progressionfreesurviva，PFS）为接受手术时间起至疾病进展或末次随访时间。生存分析采用Kaplan-Meier，组间差异行log-rank比例风险回归模型进行多因素分析。P＜0.05ALKHCC组织中的表达荧光原位杂交结果显示，213例HCC组织样本中未发现ALK基因重排阳性病例通过计数ALK基因拷贝数，发现28例存在ALK-CNG 现象，见图1。ALK-CNG阳性表达水平与HCC患者临床病理特征的关系ALK-CNGHCC患者年龄、性别、AJCC分期、Child-Pugh评分及复发情况均无明显相关性（P＞0.05）1。ALK-CNG表达与HCC患者预后的关系20121242.47147例因肿瘤死亡。Kaplan-Meier法分析显示，213HCC患者353.0%40.8%ALK-CNG338.1%，ALK-CNG阴性组为57.6%（P=0.089），2AALK-CNG阳性组患者327.3%，ALK-CNG42.5%差异有统计学意义（P=0.048），2B进一步按临床分期进行分层分析，结果显示，晚期（Ⅲ+Ⅳ期）患者中，ALK-CNG阳性者（n=7）与阴性者（n=32）3年总生存率分别为0和40.6%，差异无统计学意义（P=0.054），见图2C。ALK-CNG 阳性者3年无进展生存率为0明显低于ALK-CNG 阴性者的33.5%（P=0.007），见图2D。在早期（I+Ⅱ期）患者中，ALK-CNG 阳性者（n=21）和阴性者（n=153）3年总生存率分别为56.7%和61.8%，差异无统计学意义（P=0.394），见图2E；无进展生存率分别为36.9%和44.4%，差异亦无统计学意义（P=0.314），见图2F。单因素和多因素分析结果单变量回归分析显示ALK-CNG阳性（HR=1.479，95%CI：0.939～2.329，P=0.091）并非HCC患者总生存率的预后预测因子。无进展生存率的单变量回归分析显示，ALK-CNG 阳性（HR=1.598，95%CI：1.001～2.552，P=0.049）Child-Pugh分级（HR=2.165，95%CI：1.300～3.608，P=0.002）AJCC分期（HR=1.926，95%CI：1.304～2.845，P=0.001）HCC患者的独立预后因子。多因素回归分析结果显示，ALK-CNG阳性（HR=1.596，95%CI：1.008～2.526，P=0.046）、Child-Pugh分级（HR=1.744，95%CI：1.021～2.979P=0.042）AJCC分期（HR=1.775，95%CI：1.179～2.673，P=0.006）是HCC患者无进展生存率的预后预测因子，ALK-CNG 阳性是HCC患者独立的预指标。ALK基因在多种肿瘤中表达异常，且与肿瘤的发生、发展相关。有学者RT-PCR法检测ALK23290例乳腺癌患者中均未发现ALK基因重排阳性［14］，Lin［15］209例乳腺癌患者ALK2.4%213HCC组织中ALKALK基因重排阳性患者。由此可见，ALK基因重排在HCC中的阳性表达率并不高。ALKALK基因扩增及拷贝数增加。2002年，Miyake等［16］首次报道在神经母细胞瘤中存在ALK基因扩增，其发生率明显高于肿瘤组织。ALK基因扩增与神经母细胞瘤患者预后的关系尚不清楚［17］，但研究发现ALKALK基因扩增的神经母细胞瘤细胞株表现出了抑制其细胞增殖及促进细胞凋亡的作用［18-19］，因此，针对ALK基因扩增的靶向治疗仍有望成NSCLC脑转移的组织ALKALK基因扩增现象，其发生率约10%［20-21］。另外在炎性乳腺癌组织样本中也发现存在ALK基因扩增［22］，且有学者通过动物实验证实低剂量的ALK抑制剂克唑替尼可使该类肿瘤缩小［23-24］NSCLC组织样本中，ALK基因扩增现象亦较明显，有研究表ALKALK基因扩增现象［25］ALK基因扩增相比，ALK基因拷贝数增加在肿瘤组织中的发生率较高。在神经母细胞瘤中，ALK-CNG10%～20%［26］NSCLC中，有35.2%～63.6%的组织样本存在ALK-CNG［27］。本研究虽未发现ALK基因重排阳性病例，但亦观察到ALK-CNG 现象其发生率为13.15%。目前已有研究表明ALK的异常表达与某些肿瘤的恶性程度或预后相关。在高级别（Ⅲ级、Ⅳ级）胶质瘤中，ALK的表达广泛且较显著［28］，约50%的ALK阳炎性肌纤维母细胞瘤患者易复发［29］。本研究亦发现，ALK-CNG 阳性与HCC患者的预后较差相关（P=0.048），对HCC患者无进展生存期有一定影响，可能成为HCC患者独立的预后指标。综上所述，本研究在HCC患者组织样本中未发现ALK基因重排阳性患者，但存在ALK基因拷贝数增加现象，且ALK-CNG阳性与HCC患者预后相关。因此，在指导HCC患者的个体化治疗中，ALK-CNG可能是一个有效的指标，有望用于患者预后评估，也可能为HCC的个体化治疗提供依据。但本研究未能在肿瘤组织样本中检测其他基因的表达情况，ALK-CNG 与其他基因表达的关系，仍需进一步研究同时ALK-CNG在肿瘤细胞系中的功能及调控机制尚不清楚，值得进一步研究。【相关文献】［1］FerlayJShinHR，Brayetal.Estimatesofworldwideburdenofcancerin208GLOBOCAN2008 ［］.IntJCancr2010127（12）：2893-2917.［2］YangYB，LuYY，WangCP，etal.CryotherapyisassociatedwithimprovedclinicaloutcomesofsorafenibforthetreatmentofadvancedhepatocellularTherMed，2012，3（2）：171-180.［3］BaekYH，KimKT，LeeSW，etal.Efficacyofhepaticarterialinfusionchemotherapyinadvancedhepatocellularcarcinoma］.WorldJGastroentero，2012，18（26）：3426-3434.［4］CaoH，PhanH，YangLX.Improvedchemotherapyforhepatocelluarcarcinoma，32（4）：1379-1386.［5］CervelloM，McCubreyJA，CusimanoA，etal.Targetedtherapyforhepatocellularcarcinoma：novelagentsonthehorizon［J］.Oncotarget，2012，3（3）：236-260.［6］TanakaS，AriiS.MoleculartargetedtherapiesinhepatocellularcarcinomaOncol，2012，39（4）：486-492.［7］PalmerRH，VernerssonE，GrabbeC，etal.Anaplasticlymphomakinase：signallingindevelopmentanddiseaseJ，2009，420（3）：345-361.［8］SodaM，ChoiYL，EnomotoM，etal.IdentificationofthetransformingEML4-ALKfusiongeneinnon-small-celllungcancr］.Nature，2007，448（7153）：561-566.［9］GeorgeRE，SandaT，HannaM，etal.ActivatingmutationsinALKprovidetherapeutictargetinneuroblastoma［J］.Nature，2008，455（7215）：975-978.［10］CamidgeDR，BangYJ，KwakEL，etal.ActivityandsafetyofcrizotinibinpatientswithALK-positivenon-small-celllungcancrupdatedresultsfromaphase1studyOncol，2012，13（10）：1011-1019.［11］TiseoM，GelsominoF，BartolottiM，etal.Anaplasticlymphomakinaseasanewtargetforthetreatmentofnon-small-celllungcane］.ExpertRevAnticancerThr2011，11（11）：1677-1687.［12］ShawAT，KimDW，NakagawaK，etal.CrizotinibversuschemotherapyinadvancedALK-positivelungEnglJMed，2013，368（25）：2385-2394.［13］SunY，RenY，FangZ，etal.LungadenocarcinomafromEastAsiannever-smokersisadiseaselargelydefinedbytargetableoncogenicmutantkinae］.JClinOncl2010，28（30）：4616-4620.［14］FukuyoshiY，InoueH，Kitaal.EML4-ALKfusiontranscriptisnotfoundingastrointestinalandbreastcances］.BrJCance，2008，98（9）：1536-1539.［15］Lin，Li，GuanY，etal.ExonarrayprofilingdetectsEML4-ALKfusioninnon-smallcelllungMolCancerRes，2009，7（9）：1466-1476.［16］MiyakeI，HakomoriY，ShinoharaA，etal.ActivationofanaplasticlymphomakinaseisresponsibleforhyperphosphorylationofShcCinneuroblastomacelllines，2002，21（38）：5823-5834.［17］AzarovaAM，GautamG，GeorgeRE.EmergingimportanceofALKneuroblastomaCancer，21（4）：267-275.［18］Janoueix-LeroseyD，Brugièresal.SomaticandgermlineactivatingmutationsoftheALKkinasereceptorinneuroblastoma［J］.，455（7215967-970.［19］GrandeE，BolósMV，ArriolaE.TargetingOncogenicALK：APromisingStrategyforCancerTreatmentCancerTher，2011，10（4）：569-579.［20］SchoppmannSF ，StreubelP.AmplificationbutnottranslocationofanaplasticlymphomakinaseisafrequenteventinoesophagealcancerJ2013，49（8）：1876-1881.［21］PreusserM，BerghoffAS，Ilhan-MutluA，etal.ALKgenetranslocationsandamplificationsinbrainmetastasesofnon-smallcelllungcancr.LungCancer，201380（3）：278-283.［22］RobertsonFM，PetricoinIiiEVanLaereSJ，etal.Presenceofanaplasticlymphomakinaseininflammatorybreastcancer，2［23］TumaRS