DNA重组和基因转移

第七章DNA重组和基因转移

第一节目的基因与载体的连接一、粘末端DNA片段的连接（一）具有相同粘末端的DNA分子之间的连接

使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化。（二）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接

用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。

HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI对载体酶切HindIIIEcoRI对基因酶切质粒载体的定向重组二、平末端DNA片段的连接1、直接用T4连接酶连接2、同聚物加尾法3、衔接物连接法衔接物是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。三、载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接

4、DNA接头连接法

接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端，先利用齐平末端连接方法将它与平端的外源DNA连接起来，造成人工粘性末端，即可再与之互补的粘性末端的载体DNA相连接。

所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配，指载体与待克隆的DNA片段上的酶切位点不相同，因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘性末端。

1、按照平末端连接方法加上接头。2、将凹端变为平端（1）使用Klenow酶在4种dNTP存在下，将3′凹端完全补平。（2）用S1核酸酶去除3′突出末端产生平端DNA分子

3、使用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段部分补平3′凹端转变成粘端。TCGAAGCTGATCCTAG载体经xhoI酶切形成：外源基因用San3A酶切形成：用Klenow酶部分补平二者的3′凹端，形成：TCGAAGCTGATCCTAGCTTCAGGA这样，就可以实现有效重组。3′3′3′3′5′5′5′5′四、cDNA与载体的连接通过依次加入、连接合成的DNA接头进行cDNA克隆第二节重重组DNA分分子的筛选与与鉴定外源基因与载载体连接后转转化大肠杆菌菌可能的三种种情况：（1）（2）（3）转化E.coli一、遗传检测测法（一）根据载载体表型特征征选择重组体体分子1、抗药性标记记插入失活筛筛选法例：pBR322如果外源基因因插入到tetr基因内部，tetr抗性消失，表表型为不抗四四环素（tets）、而仍抗氨苄青青霉素（ampr），这样的转化细细胞在含有amp的培养基仍可可生长，但在在含有四环素素的培养基上上不能再生长长；反之，如如果ampr基因由由于外外源基基因插插入其其内部部而失失活，，带有有重组组DNA分子的的转化化细胞胞在含含有tet的培养养基平平板上上生长长，在在含有有amp的培养养基不不能生生长。。插入失失活法法筛选选重组组子2、α——互补补例；pUC质粒粒在LacZ—的大肠肠杆菌菌中，，在平平板培培养中中，菌菌落是是白色色的。。若在在该细细胞中中引入入pUC质粒，，其上上有LacZ′，质粒和和大肠肠杆菌菌DNA可实现现α—互补，，菌落落呈蓝蓝色。。如果在在质粒粒的多多克隆隆位点点的某某个酶酶切点点上克克隆了了外源源基因因，则则LacZ′基因受受到破破坏，，便不不能再再和缺缺陷型型受体体菌中中生成成有活活性的的β-半乳糖糖苷酶酶，因因此，，菌落落呈白白色。。（二））根据插插入序序列的的表型型特征征选择择重组组体进入受受体细细胞的的重组组DNA分子中中的外外源基基因如如果在在宿主主细胞胞中能能实现现功能能表达达，产产生出出有功功能活活性的的基因因产物物，那那么鉴鉴定此此种重重组体体最简简便的的方法法就是是表型型特征征的直直接选选择法法。二、物物理检检测法法1、凝胶胶电泳泳检测测法2、R-环法在临近近双链链DNA变性温温度下下和高高浓度度（70%）的甲甲酰胺胺溶液液中，，即所所谓的的R-环条件件下，，双链链的DNA-RNA分子要要比双双链的的DNA-DNA分子更更为稳稳定。。因此此，将将RNA和DNA的混合合物置置于这这种条条件下下，RNA便会同同双链链DNA分子中中与之之互补补的序序列退退火形形成稳稳定的的DNA-RNA杂交分分子，，而另另一条条DNA链则成成为单单链状状态。。这种种由单单链DNA分支和和双链链DNA-RNA分支形形成的的“泡泡状””体，，叫做做R-环结构构。三、核核酸杂杂交检检测法法例：原位杂杂交筛筛选重重组体体菌落落(或噬菌菌斑)四、免免疫化化学检检测法法免疫化化学检检测法法是利利用抗抗体与与抗原原结合合的高高度特特异性性来鉴鉴别基基因的的。如如果某某个重重组克克隆中中的外外源基基因能能够表表达，，在这这个克克隆中中就存存在着着这个个基因因的特特定蛋蛋白，，即可可用特特异性性抗体体来检检测。。常用用的有有标记记抗体体测定定法和和免疫疫沉淀淀测定定法两两种。转化菌菌落影印平平板置于含含氯仿仿饱合合气体体的容容器细菌裂裂解，，抗原原释放放覆盖吸吸附有有未经经标记记的抗抗体的的NC膜形成抗抗原抗抗体复复合物物将NC膜与I125标记的的抗体体温育育放射自自显影影与母板板对照照，挑挑取所所需的的重组组克隆隆标记抗抗体测测定法法的步步骤：：用免疫疫化学学法检检测克克隆在在表达达载体体pUC8上的基基因五、DNA-蛋白质质筛选选法六、转转译筛筛选法法原理：：外源DNA蛋白质质翻译能与某某一特定DNA序列结结合作为探探针与与克隆隆群体体杂交交转译筛筛选法法是通通过体体外转转译的的手段段鉴定定阳性性克隆隆的方方法，，可分分为杂杂交抑抑制转转译和和杂交交选择择转译译两种种方法法。1．杂交交抑制制转译译要求：：被研研究的的目的的基因因编码码有丰丰富的的mRNA。。DNA蛋白质mRNA蛋白质×杂交原理：：步骤：：转化菌菌落提取重重组DNA与mRNA总杂交交形成DNA-RNA杂种分分子将总mRNA（（包括DNA-RNA分子提取出出来体外转转译蛋白电电泳放放射自自显影影（（1））总mRNA体外转转译蛋白电电泳放放射自自显影影（（2））经对比比，（（1））比（（2））中少少了一一种蛋蛋白质质找到一种种转译作作用被抑抑制了的的mRNA筛选出重重组菌落落（或噬噬菌斑））2、杂交选择择转译观察到在这种杂杂交选择择的转译译中，存存在着一一种特殊殊活跃的的mRNA。重组体库库提取DNA固定在NC膜上与mRNA或总RNA杂交目的基因因与对应应的mRNA杂交，mRNA固定在NC膜上将分离mRNA的进行体体外转译译凝胶电泳泳或生物物活性检检测找出单菌菌落重组组体第三节基基因转转移方法法一、重组DNA导入大肠肠杆菌（一）转化将外源DNA分子导入入某一宿宿主细菌菌细胞的的过程都都叫转化。为了有效效地使细细菌吸收收外源的的DNA分子，我我们通常常要对它它们进行行一些物物理或化化学的处处理，处处理后的的细胞吸吸收外源源DNA的能力大大大提高高，被称称为感受态细细胞。对于大肠肠杆菌细细胞，一一般采用用50mmol/L的CaCl2溶液来制制备感受受态细胞胞。（1）吸吸附阶段段：完整整的双链链DNA分子吸附附于感受受态细胞胞表面。。（2）转转入阶段段：双链链DNA分子解链链，以单单链形式式进入细细胞，而而另一链链则被降降解。（3）自自身稳定定阶段；；外源质质粒在细细胞内又又复制成成双链环环型DNA。。（4）表达阶段段：即目目的基因因随质粒粒的复制制子一起起复制，，并被转转录、转转译。DNA分子转化化的过程程：质粒DNA的大小及及构型对对转化效效率的影影响：（1）大大小＞10Kb，转化效率率很低（2）构构型超超螺螺旋＞环形＞线状（二）转转染（2）λλ噬菌体体的体外外包装转染(transfection)：是指感受受态的受受体细胞胞捕获和和表达以以噬菌体体为载体体的重组组DNA分子的过过程。（1）转转导和转转染的区区别转导(transduction)：通过λ噬菌体（（病毒））颗粒感感染宿主主细胞的的途径把把外源DNA转移到受受体细胞的过过程。转染：λ噬菌体DNA分子直接接导入受受体细胞胞的过程程。体外包装装：是指指在体外外模拟λ噬菌体DNA在受体细细胞内的的一系列列特殊的的包装反反应过程程，将重重组λ噬菌体DNA分子包装装成为成成熟的具具有感染染能力的的λ噬菌体颗颗粒的技技术。λ噬菌体体的体外外包装的的原理：：根据λ噬菌体DNA的体内包包装途径径，分别别获得缺缺失D包装蛋白白的λ噬菌体突突变株和和缺失E包装蛋白白的λ噬菌体突突变株。。由于不不具备完完整的包包装蛋白白，这两两种突变变株均不不能单独独包装λ噬菌体DNA，，但将两种种突变株株分别感感染大肠肠杆菌，，从中提提取缺失失蛋白D的包装物物（含E蛋白）和和缺失E蛋白的包包装物（（含D蛋白），，两者混混合后就就能包装装λ噬菌体DNA。。二、重组DNA导入植物物细胞的的方法（一）载载体介导导的转化化方法1、共培养法法(cocultivation)该方法是是Marton等1979年以原生生质体为为受体建建立起来来的，随随后经过过一系列列的改进进，现在在是植物物基因工工程中最最常用的的一种转转化方法法。该方方法的主主要原理理是将受受体与供供体在一一起培养养，通过过接触感感染而发发生转移移，供体体常用农农杆菌、、病毒载载体等形形式。（1）原原生质体体共培养法法取含重组组Ti质粒的农农杆菌同同刚刚长长出细胞胞壁的原原生质体体作短暂暂的共培培养，促促使农杆杆菌和植植物细胞胞之间发发生遗传传物质的的转化。。①从烟草草无菌苗苗中分离离原生质质体，并并预培养养24小小时。②原生质质体与农农杆菌混混合培养养，原生生质体浓浓度l05／ml、、农杆菌l07／ml，，20℃℃下保温32小时时。③冲洗去去游离的的细菌，，将原生生质体培培养在有有抗生素素(250mg／L万古霉素素，200mg／L羧苄青霉霉素，200mg／L链霉素)的培养养基中，，这些抗抗生素抑抑制细菌菌生长，，而对原原生质体体无毒害害。④3周后，离离心收集集细胞团团，再培培养在无无激素培培养基上上，2周内，转转化的细细胞团是是激素非非依赖性性生长细细胞团，，在该培培养基中中可快速速生长，，而非转转化的细细胞团则则生长很很慢，最最后变褐褐死亡。。烟草原生生质体与与Ti质粒转移移的共培培养法程程序为：（2）叶盘共共培养法法图该方法最最早由Horsch(1985)首创，用用于烟草草转化。优点：适适用性广广，对于于那些能能被农杆杆菌感染染的、并并能从叶叶子再生生植株的的各种植植物均适适用。（3）悬悬浮细胞胞或愈伤伤组织共共培养（4）活体接接种(inoculationinvivo)原则上，，该种共共培养与与原生质质体共培培养的方方法和步步骤是相相同的，，在供体体上，则则必须是是有侵染染和感染染能力的的载体系系统，如如带有Ti质粒的的根癌癌农杆杆菌。。所谓整整体植植株接接种转转化法法，是是指人人为地地在整整体植植株上上造成成创伤伤部位位，然然后把把农杆杆菌接接种在在创伤伤表面面，或或用针针头把把农杆杆菌注注射到到植物物体内内，使使农杆杆菌按按照天天然的的感染染过程程在在植物物体内内进行行侵染染，获获得转转化的的植物物愈伤伤组织织或转转基因因植株株。接接种后后2-3周周，切切下接接种处处部分分组织织培养养4周周，可可产生生愈伤伤组织织，进进一步步通过过分化化培养养可获获得转转基因因植株株。2、病毒介介导的的基因因转移移（1）双链链DNA病毒转转化载载体这类病病毒是是以双双链DNA作为遗遗传物物质，，在这这类病病毒中中，目目前研研究的的最多多的是是花椰椰菜花花叶病病毒（（简称称CaMV,CaullinusMozicVirus）。（2）单链链DNA病毒转转化载载体GeNV顾名思思义，，可翻翻译成成“双双联体体病毒毒”或或“孪孪生病病毒””。GeNV的感染染范围围较广广，包包括单单子叶叶和双双子叶叶植物物，它它们的的传播播媒介介是昆昆虫。。（3）单链链RNA病毒转转化载载体迄今为为止，，还没没有建建立起起一个个完善善的以以植物物RNA病毒为为基因因载体体的基基因转转化体体系，，但是是RNA病毒仍仍是一一个很很有希希望作作为基基因工工程载载体的的植物物病毒。。（二））DNA直接导导入法法1、物理理方法法（1））基因因枪法法80年年代末末期，，由康康奈尔尔大学学的Sanford最先提提出，，主要要是为为了克克服以以往各各种基基因转转化技技术的的局限限。该方法法是利利用一一种物物理仪仪器装装置，，将钨钨、金金等金金属微微粒加加速冲冲击细细胞，，把细细胞击击孔，，使目目的基基因进进入受受体。。首先将将钨、、金微微粒(直径约约0.4μm，重量约约0.05mg)与供体体DNA溶液(1～2μl)混合并并保温温，使使DNA吸附在在金属属微粒粒的表表面，，然后后将该该溶液液置于于所谓谓的““基因因枪””仪器器中，，仪器器高压压放电电将金金属微微粒加加速，，直接接喷射射受体体原生生质或或细胞胞，细细胞击击穿成成孔后后，在在钨粒粒上的的DNA以及溶溶液中中的DNA都可以以进入入受体体细胞胞。操作技技术程程序为为：基因枪枪示意意图基因枪枪所用用材料料：（1））钨粉粉使用用起来来经济济实惠惠，也也可以以得到到较好好的转转化效效果；；但容容易被被氧化化，颗颗粒易易聚集集，并并且对对植物物细胞胞的毒毒害也也比金金粉大大。（2））将DNA包被到到微载载体上上所用用的试试剂有有亚精精胺、、CaCl2、乙醇、、聚乙乙二醇醇、异异丙醇醇等，，但多多用前前两种种。（3））所用用动力力系统统：一一类以以火药药爆炸炸力作作为动动力加加速微微弹；；另一一类以以电弧弧放电电蒸发发液滴滴作为为动力力；第第三类类以高高压蒸蒸汽作作为动动力。。基因枪枪法的的特点点：（1））转化化效率率高。。（2））受体体广泛泛。（3））操作作简单单。（2））电激法法(electroperation)电激法法是利利用高高压电电脉冲冲的作作用对对原生生质体体或细细胞击击出微微孔而而使基基因转转移的的一种种新方方法。。原理：：细胞生生物学学研究究证明明，细细胞膜膜的磷磷脂双双分子子层可可视为为一种种电容容，其其静膜膜电位位（Vm）约为l00mV，导电性性很差差。当当把细细胞置置于外外加电电场中中时，，会使使膜电电位升升高，，双分分子层层两端端电压压形成成差势势，随随着外外加电电场电电压升升高，，细胞胞膜被被压缩缩变薄薄，当当膜电电压升升到一一定数数值时时，膜膜被击击穿。。可逆击击穿：：击穿穿小孔孔可在在一定定时间间内复复原。。不可逆逆击穿穿：击击穿小小孔不不可修修复，，处理理细胞胞成活活率低低。操作程程序：：将盛有有细胞胞和DNA混合物物的特特制小小容器器置于于电脉脉冲仪仪的正正负极极之间间，在在0度下加高高压（（2～4KV）），电脉冲冲10分钟钟后，，将待待处理理的细细胞转转移到到新鲜鲜培养养基中中生长长2天天，再再进行行筛选选。存存活细细胞的的回收收率约约为60%～80%。（3）微注注射法法（micro-injection）微量注注射：：用注注射针针或微微针在在受体体细胞胞或组组织穿穿刺成成孔，，DNA随穿刺刺孔进进入细细胞或或随穿穿刺针针头——道进进入。。真正的的显微微注射射：利利用显显微注注射仪仪，通通过机机械方方法把把外源源DNA直接注入细胞胞质或细胞核核的基因转化化方法。显微注射技术术的关键是原原生质体或具具壁细胞或细细胞团的固定定。对于植物物细胞而言，，首先必须建建立固定细胞胞技术，然后后才能进行定定位显微注射射操作。常用用的细胞固定定方法有3种种：一、琼脂糖包包埋法二、多聚赖氨氨酸粘连法三、吸管支持持法（4）激光微束法法(lasermicrobeam)（5）超声波法此方法是利用用直径很小、、能量很高的的激光微束引引起细胞膜可可逆性穿孔的的原理，在荧荧光显微镜下下找出合适的的细胞，然后后用激光光源源代替荧光光光源，聚焦后后发出激光微微束脉冲，造造成膜穿孔，，处于细胞周周围的外源DNA分子随之进入入细胞。基本原理：是是利用低声强强脉冲超声波波的物理作用用，击穿细胞胞膜造成通道道，使外源DNA进入细胞。利用超声波处理可可避免脉冲高高压对细胞的的损伤作用，，有利于原生生质体的存活活，是一种有有潜力的转化化途径。（6）离子束法离了束作用在在生物表面后后可引起电子子溅射，离子子束的溅射好好象一把手术术刀，对生物物体进行微细细加工，使生生物体表面层层层剥离，原原来不连通的的通道在一定定距离内连通通，后来的离离子就可穿行行较长的距离离，落在预定定的位置上。。2．化学方法（1）PEG法是细胞融合剂剂，它可以使使细胞膜之间间或DNA与膜之间形成成分子桥，促促使相互之间间的接触和粘粘连；还可以以引起膜表面面电荷的紊乱乱，干扰细胞胞间的识别，，从而有利于于细胞膜之间间的融合和外外源DNA进入原生质体体。(2)脂质体体法脂质体是由人人工构建的磷磷脂双分子层层组成的膜结结构，可将DNA包在其内，并并通过脂质体体与原生质体体的融合或由由于原生质体体的吞噬过程程，把外源DNA转运到细胞内内。早期：丝氨酸酸磷酸+胆固固醇第二代：二油油酰乙醇胺磷磷脂+胆固醇醇+软脂酸3、种质系统法(germlinetransformationsystem)（1）花粉管通道道法（pollen-tubepathway）在显花植物中中利用花粉在在柱头上萌