基于高通量技术的肿瘤研究2015年

基于高通量技术的肿瘤研究

标题1、肿瘤基因组学研究背景2、基于高通量技术的肿瘤研究思路3、肿瘤研究协作组1、肿瘤基因组学研究背景肿瘤的发生是突变不断累积的过程Stratton,M.R.,P.J.Campbell,etal.(2009).Nature458(7239):719-724.肿瘤基因组的变异类型nature,2009,458(9),723MacConaill,L.

JournalofClinicalOncology(2010)StrattonMR,etal.(2009)Nature,458,723点突变，小的插入与缺失，拷贝数变异，染色体内或间的重排肿瘤基因组的变异类型J.C.Mwenifumbo,M.A.Marra,NatRevGenet14,321(May,2013).肿瘤的异质性研究M.Gerlingeretal.,NEnglJMed366,883(Mar8,2012).2.基于高通量技术的肿瘤研究思路TranscriptionalComplex转录复合体preRNA初级转录本mRNA：可变剪切，RNA编辑FunctionalRNA：miRNA,siRNA,piRNA,lncRNA等DNA：细胞突变/种系突变DNAmodification：DNA甲基化Protein-DNAInteraction：组蛋白修饰，转录因子调控Non-codingRNA：RNA干扰和RNA指导的基因沉默蛋白调控机制调控DNA变异检测技术：全基因组重测序(WholegenomeResequencing)外显子测序(Exome-seq)目标区域测序(Targetregionseq,eg.MHC)基因分型表观调控分析技术：全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)甲基化

DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)基于酶切消化的重亚硫酸盐测序(RRBS)染色质免疫共沉淀测序(ChIP-Seq),小RNA测序(miRNA-seq)RNA表达分析技术：转录组测序(Transcriptomeseq)表达谱测序(RNA-Seq)小RNA测序(miRNAseq)长非编码RNA测序(lncRNAseq)蛋白分析技术：蛋白质全谱分析目标蛋白分析(MRM)蛋白定量分析蛋白修饰分析胶点胶条分析发病机理

华大技术平台

肿瘤研究成果Sung,W.K.,H.Zheng,etal.(2012)."Genome-widesurveyofrecurrentHBVintegrationinhepatocellularcarcinoma."Naturegenetics44(7):765-769.Ren,S.,Z.Peng,etal.(2012)."RNA-seqanalysisofprostatecancerintheChinesepopulationidentifiesrecurrentgenefusions,cancer-associatedlongnoncodingRNAsandaberrantalternativesplicings."CellResearch22(5):806-821.Singh,D.,J.M.Chan,etal.(2012)."TransformingFusionsofFGFRandTACCGenesinHumanGlioblastoma."ScienceSignalling337(6099):1231.Xu,X.,Y.Hou,etal.(2012)."Single-cellexomesequencingrevealssingle-nucleotidemutationcharacteristicsofakidneytumor."Cell148(5):886-895.Hou,Y.,L.Song,etal.(2012)."Single-CellExomeSequencingandMonoclonalEvolutionofaJAK2-NegativeMyeloproliferativeNeoplasm."Cell148(5):873-885.Gui,Y.,G.Guo,etal.(2011)."Frequentmutationsofchromatinremodelinggenesintransitionalcellcarcinomaofthebladder."Naturegenetics43(9):875-878.Guo,G.,Y.Gui,etal.(2011)."Frequentmutationsofgenesencodingubiquitin-mediatedproteolysispathwaycomponentsinclearcellrenalcellcarcinoma."Naturegenetics44(1):17-19.Hollink,I.,Q.Feng,etal.(2011)."LowfrequencyofDNMT3AmutationsinpediatricAML,andtheidentificationoftheOCI-AML3celllineasaninvitromodel."Leukemia.Hou,J.,L.Lin,etal.(2011)."IdentificationofmiRNomesinhumanliverandhepatocellularcarcinomarevealsmiR-199a/b-3pastherapeutictargetforhepatocellularcarcinoma."Cancercell19(2):232-243.

肿瘤研究方案解决的科学问题研究方案技术平台肿瘤发生、发展相关分子机制研究散发样本群体水平鉴定高频变异基因全基因组测序外显子测序鉴定肿瘤组织中特异基因融合和异常表达转录组测序小RNA测序肿瘤异质性及亚克隆演化研究单细胞测序全基因组高深度测序鉴定肿瘤组织中lncRNA异常表达lncRNA测序鉴定肿瘤组织异常表观遗传修饰RRBS、MeDip、Chip-Seq鉴定病毒相关肿瘤样本病毒整合位点病毒整合位点捕获测序肿瘤干细胞研究单细胞测序转录组测序肿瘤易感基因研究鉴定散发/家族性样本鉴定肿瘤易感基因和位点NGS/Array-basedGWAS肿瘤转移及复发分子机制研究鉴定肿瘤复发/转移相关基因变异信息单细胞测序全基因组测序外显子测序肿瘤药物治疗反应研究鉴定肿瘤药物敏感性和抗性相关变异信息全基因组测序外显子测序肿瘤无创诊断、预后研究鉴定肿瘤无创诊断、预后的分子标记物miRNA测序、CTC平台Cell-free平台病毒VirusFamilyCancertypeMechanismOncogenesOncogenefunctionReferences乙肝病毒HepatitisBvirus(HBV)HepadnaviridaeHepatocellularcarcinomaChronicinflammationXproteinMolecular-signalingdysregulationinhibitionofp53(GanemandPrince,2004;GuidottiandChisari,2006;KaoandChen,2002)丙肝病毒HepatitisCvirus(HCV)FlaviviridaeHepatocellularcarcinomaChronicinflammationNone—(Colomboetal.,1989;Thomasetal.,2000)EB病毒Epstein–Barrvirus(EBV)(HHV-4)HerpesviridaeLymphoma,NasopharyngealcarcinomaOncogenicLMP-1MolecularsignalingdysregulationNF-kBactivationlymphoproliferation(Arvanitakisetal.,1995;Brownetal.,2001;Mosialosetal.,1995)人乳头瘤病毒Humanpapillomavirus(HPV)PapillomaviridaeCervicalcancer,Analcancer,Peniscancer,HeadandneckcarcinomaOncogenicE6/E7Inhibitionofp53andRbCellAdhesiondysregulation(Beaudenonetal.,1986;Dysonetal.,1989b;Scheffneretal.,1990)人嗜T淋巴细胞病毒HumanTlymphotropicvirustype1(HTLV-1)RetroviridaeAdultT-cellleukemiaOncogenicTaxMolecular-signalingdysregulationNF-kBactivationimmortalization(MatsuokaandJeang,2007;Poieszetal.,1980)KSH病毒Sarcoma-associatedherpesvirus(KSHV)(HHV-8)HerpesviridaeKaposi’ssarcoma,PleuraleffusionlymphomaOncogenicvGPCR,vIL-6,vBcl2,vMIPs,vFlip,vCyclinLANA,KaposinBMultiple-signalingeventsCellcycledysregulationInhibitionofapoptosisImmuneevasionAutocrineandparacrinefunctions(Arvanitakisetal.,1997;Baisetal.,1998;Cesarmanetal.,1995;Changetal.,1994;Ganem,2006;Montaneretal.,2003;Yangetal.,2000)病毒相关肿瘤研究世界范围内，10%-15%的肿瘤都和病毒感染有关系。病毒感染肿瘤样本收集DNA、RNA提取DNA样本用于鉴定病毒整合位点和病毒分型RNA样本用于mRNA表达谱的分析病毒整合对基因表达影响TALEN靶向敲除细胞系实验研究基因功能以病毒插入宿主基因组为切入点，检测病毒插入的位点和热点，并研究病毒插入对基因表达的影响，通过后续生物学功能实验鉴定基因功能。病毒相关肿瘤研究病毒捕获测序是根据病毒的序列来设计捕获探针，把宿主基因组片段化之后再与捕获芯片杂交，在捕获到病毒序列同时也把整合的宿主DNA序列捕获下来，后续对捕获下来的序列进行测序以及生物信息分析，以达到全基因组水平检测病毒的整合位点和热点、病毒分型的目的。DirectsequencingandcharacterizationofaclinicalisolateofEpstein–Barrvirusfromnasopharyngealcarcinomatissueusingnext-generationsequencingtechnology通过NGS技术研究NPC病人癌组织，成功组装了基因组为164.7kb的EBV新亚型，命名为GD2。序列和系统进化分析了GD2和一般EBV的关系。这是第一篇用NGS方法来研究NPC活体癌组织的EBV文章，文章中用到的研究思路和EBV基因组组装的方法可以借鉴于其他病原体引起的恶性肿瘤研究。Liu,P.,X.Fang,etal.(2011).JournalofVirology85(21):11291-11299.

拟解决科学问题：鉴定肿瘤中频发的基因融合，验证基因融合在肿瘤发生、发展过程中的重要作用，并筛选出可用于治疗或者预后的分子标记物。NSCLC非小细胞肺癌,个性化突破癌症融合基因研究

背景：在血液癌中，已经有两百多个基因融合被鉴定出，占已知的人类肿瘤相关基因融合的75%，它们已经被广泛应用于药物靶点的开发。最近发现包括胃癌、前列腺癌等实体瘤中，融合基因也起着关键作用，可以作为一个新的生物标记物

。研究意义：相关特异性融合基因及致癌作用机理

候选融合基因作为临床相关分型及治疗的靶标

研究方案总RNA提取样本选取文库构建高通量测序生物信息学分析技术验证功能验证前期选取10-15例样本进行初筛，样本具有明确的临床信息，肿瘤组织中的肿瘤细胞含量达到80%以上。制备总RNA5μg，样品浓度≥65ng/µl，OD260/280=1.8~2.2。通过Agilent2100检测浓度、28S/18S、RIN值。构建200bp插入片段文库，IlluminaHiseq2000测序，产出不少于8Gcleandata。通过华大自主研发的基因检测软件SOAPfuse进行融合基因检测，同时还分析可变剪接、差异表达、新转录组预测以及SNP分析采用FISH、Sanger测序或者RT-PCR的方法进行技术验证首先选取候选的高频融合基因在更大样本量（一般推荐50对样本以上）中验证，后续再对验证后的位点进行功能实验验证。14对样本转录组测序频发基因融合鉴定、长非编码RNA分析可变剪接分析、体细胞突变检测ChanghaiHospital&BGITMPRSS2-ERG

白种人：

(50%,high,previouspublished)中国人：(18.5%,low,FISH)中国人群特异:CTAGE5-KHDRBS3

(20/54=37%)USP9Y-TTTY15

(19/54=35.2%)12/22/2022基于单细胞技术的肿瘤异质性研究研究背景：肿瘤的发生是具有不同生长优势的细胞克隆进化的结果，组成肿瘤组织内部的细胞具有不同的遗传变异信息，即具有异质性。单细胞测序能够精确描绘单个细胞内基因组变异信息，为微量样本、肿瘤的异质性以及克隆演化提供有效的研究平台。单细胞测序技术

整体研究方案12/22/2022样本选取空间轴肿瘤不同病灶的异质性已在多种癌症中被证实，因此对于具有较大肿瘤组织的样本（原发/转移），需要进行分割处理，研究其异质性。分割区域：建议3个以上，可以根据前期实验初步判定各分区的异质性，针对性的选取12/22/2022样本选取时间轴治疗前活检样本部分病人在诊断时发现原发肿瘤，在手术前会先进行一期化疗或放疗，如果选择这类病例，建议取疗前的活检样本（biopsy），以便在后续分析时确定所测癌细胞（手术切除样本）的突变率和异质性是否受化疗影响。手术切除样本完整的样本包括原发肿瘤、近端转移瘤、癌旁或外周血。注：建议原发灶做组织病理学检查，确定肿瘤组织中癌细胞与间质细胞的比例。对原发灶建议进行分割处理。复发灶或远端转移样本手术切除肿瘤后进行治疗，一段时间后部分病人会发生原位复发或远端转移，选取再次手术切除或活检的样本。12/22/2022全基因组扩增（WGA）常用的WGA技术主要分为两种类型：1.基于热循环以PCR为基础的WGA技术,如简并寡核苷酸引物PCR(DegenerateoligonucleotideprimerPCR,DOP-PCR)、连接反应介导的PCR(ligationmediatedPCR,LM-PCR)、扩增前引物延伸反应(Primerextensionpreamplification,PEP)等；2.基于等温反应不以PCR为基础的WGA技术，如多重置换扩增(Multipledisplacemen