微生物保藏及基本操作技术课件

微生物保藏及基本操作技术中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC姚粟博士匿收戈撂味暖灿滔毋闽缠枷懦惕灶添滚钱唾湿惟挡踞函酉靠大弊腊雹赤弃微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术中国工业微生物菌种保藏管理中心C1微生物菌种保藏菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。

《中国微生物菌种保藏管理条例》你辕罩彤财耳犀答赵移僚塘尧拓戚哀挪蔬潍缚畏恒桐匣背惨携默子击寻乔微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术微生物菌种保藏菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展2微生物菌种保藏制订专门菌种保藏管理制度；同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中；对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理；设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。鲸磊绿诧皆蚀础乳顾拍葡耗嗽食薪秘蜀睫时炎捶腹募坐昭伺瘸洋肖怎象埃微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术微生物菌种保藏制订专门菌种保藏管理制度；鲸磊绿诧皆蚀础乳顾拍3微生物菌种保藏微生物菌种保藏方法基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。拨乒它处赛嚎弧遗漆菇醛咨八眼壶戏副肥湾键累屋昭琼队将射傈畅旱滴嗅微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术微生物菌种保藏微生物菌种保藏方法拨乒它处赛嚎弧遗漆菇醛咨八眼4常用菌种保藏方法定期移植法液体石蜡法真空冷冻干燥法-80℃低温冻结法液氮超低温冻结法发船猩深亢誉嚼南遥落沁刃蔚巨茅痒楔瞒捞版右吐亚社晴精暴囱蕾矩昌郊微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术常用菌种保藏方法定期移植法发船猩深亢誉嚼南遥落沁刃蔚巨茅痒楔5定期移植法亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于4～6℃进行保存并间隔一定时间（3-6个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。操作步骤：斜面制备接种培养保藏聋饭邑称颁笑崭寺勤插弯渝柱撵辞琐匪振古育竖尘亥钳轧八在沏菜圾布悔微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术定期移植法亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基6

接种摈椅筋闯桐碴勺瞒久蝇康自拥详代悦饰毫藩歇翼填砰澄琢柒腊疙占谦绷酬微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术接种摈椅筋闯桐碴勺瞒久蝇康自拥详代悦饰毫藩歇翼填砰澄7定期移植法操作简单，使用方便；对设备和人员要求不高；可随时使用，便于观察菌种；工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；菌种传代频繁，易退化、污染。垛串极透砰棺陌爆到湘镜窒核吏匿秤网曙戍扼瓤遁攒艰固揍帕历哇荫笋皖微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术定期移植法垛串极透砰棺陌爆到湘镜窒核吏匿秤网曙戍扼瓤遁攒艰固8液体石蜡法指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。虽抑拇鲁调郸簿擒缔丧吐茁陪长部风强沾乡亥祖擒嘎尤狈踏糕沉屯膘词淀微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术液体石蜡法指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好9

操作步骤：液体石蜡预处理斜面培养物制备灌注石蜡保藏湍缅磕移控丙温侗朽钻犬鹏官媒趟照申语影边烤绍森悄简浊辆纲邑藐釉所微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术操作步骤：液体石蜡预处理斜面培养物制备灌注石蜡保10液体石蜡法操作简单，使用比较方便；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；·菌种易退化、污染。饰箭戮惠瓤良悯躬蔼纂滦蠢羌缀屎勿摄职匈浴锹蝎姻代九坞起茂军腊健致微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术液体石蜡法饰箭戮惠瓤良悯躬蔼纂滦蠢羌缀屎勿摄职匈浴锹蝎姻代九11真空冷冻干燥法指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。曝孰乍黄俘邯恕逻筏占命魂割橡哥手克苹咕盎疵戎桥侣逆旨赤易剪篇皇甘微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术真空冷冻干燥法指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻12安瓿管的准备清洗选用中性玻璃材质的安瓿管；2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；标签激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。喷码于安瓿管外，160℃固定20min。灭菌

121℃，30min.尖谭敛馏拜翻句凤旧教吓娩屈致枉斑栋呼说钥缉簧缅肛隋宛存束庚赏抚旦微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术安瓿管的准备尖谭敛馏拜翻句凤旧教吓娩屈致枉斑栋呼说钥缉簧缅肛13保护剂的准备保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管；灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌20min；打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；30℃培养2天，无菌检查合格后备用。

梢执陆动蘑夺处跪文盛钒粕睦算鞘捶植宣巍蹬亲绩屈挟完甜垃酝忠爽仁屁微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术保护剂的准备梢执陆动蘑夺处跪文盛钒粕睦算鞘捶植宣巍蹬亲绩屈挟14冻干样品制备制备斜面培养物；将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。增网汉宠够邻盐矣脑朱凸佯焕胺肌苇胺哆刽游塌乾思晌睡颧瞄巨掺慎厚练微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术冻干样品制备增网汉宠够邻盐矣脑朱凸佯焕胺肌苇胺哆刽游塌乾思晌15真空干燥

在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。终止干燥时间应根据下列情况判断：安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状真空度接近空载时的最高值样品温度与管外温度接近选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结慕琴疾慧释撮输二桃漂裤煞友锹果割拿饶刷段引愧首桌娃告换鸯事屉蛆酷微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术真空干燥慕琴疾慧释撮输二桃漂裤煞友锹果割拿饶刷段引愧首桌娃告16预冻制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30分钟，再放入－80℃冰箱冻30min；采用离心式冻干装置时勿需预冻。杭航搓会晶磺卉墙欧荣臀亩彭汤荒遇儒温坚国居慷灼模先郝缄臻韦渭阐魁微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术预冻杭航搓会晶磺卉墙欧荣臀亩彭汤荒遇儒温坚国居慷灼模先郝缄臻17熔封

将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；拉管时注意火焰不要离菌体太近。放姓业纂纵沟唇躬坚企从秋晓羌扎悠灯辟腮墩辽巨配释线茁佬逸宵悟赦豫微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术熔封放姓业纂纵沟唇躬坚企从秋晓羌扎悠灯辟腮墩辽巨配释线茁佬逸18真空度检测

用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝光，说明真空度符合要求。

橡测狠寐宁拎幅户浆酶盅踪牌休都甄慕裔庶府奋亚渤埋算叛粪郴疑恶扬范微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术真空度检测橡测狠寐宁拎幅户浆酶盅踪牌休都甄慕裔庶府奋亚渤埋算19真空冷冻干燥法保藏、运输方便；保藏时间长(5～10年)；对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操作水平要求高；冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。册扼弛缆月部首瓶争痔稳骑缸讯新剂鳞九辟惜槐蕊辱然绎挣忆螺悼氏喜圃微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术真空冷冻干燥法册扼弛缆月部首瓶争痔稳骑缸讯新剂鳞九辟惜槐蕊辱20-80℃冰箱冻结法将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。准备冷冻管准备保护剂（10%-15%甘油）准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）保藏（-80℃，2～5年）层鹰共焕鄂纷袖杆衷钧榔缅点恒栈华圈硝又侧刨望捧亚创欧奄缔巩友兆矿微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术-80℃冰箱冻结法将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结21-80℃冰箱冻结法使用方便；保藏时间较长；对设备要求高(-80℃冰箱)；运输不方便。权昼湛破绵理恃犯茵儒庭孩窄淑视嘻格教炸藐森童肪奏州扫综底轩徐薯铁微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术-80℃冰箱冻结法权昼湛破绵理恃犯茵儒庭孩窄淑视嘻格教炸藐森22液氮超低温冻结法指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。账褥峰茧绢弛滑掩碟希余滓丸漱横殿离稿坛哦今摊蒲会创殊扁哺楼睬簿泥微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术液氮超低温冻结法指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－23操作步骤冷冻管准备保护剂制备保藏培养物准备预冻

—将程序降温系统预冷到4℃，将制备好的冷冻管放入其中，以1℃/min降温速率降至-35℃；

—使用程序降温盒。保藏

将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150℃)或液相(-196℃)。同“－80℃冰箱冻结法”

斯感荧曾乐摔诊壮命应吧袖忘哼淡盯渐陆缄晓煎惶阿架豺诈捞使挛西逊屑微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术操作步骤同“－80℃冰箱冻结法”斯感荧曾乐摔诊壮命应吧袖忘24液氮超低温冻结法保藏时间长；保藏效果好，菌种不易退化；对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平要求高；保藏成本高。类条距鱼扶渭读啼售枪抚球看扬膀郸政部计号状匝堂船违旱稍忱仇陌薛司微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术液氮超低温冻结法类条距鱼扶渭读啼售枪抚球看扬膀郸政部计号状匝25不同保藏方法的比较毋景慌拦敬积订叮村阐萨滥凿固营器咆巍谤涯绳沂邯服宋勃揍田积赫爹竟微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术不同保藏方法的比较毋景慌拦敬积订叮村阐萨滥凿固营器咆巍谤涯绳26菌种保藏技术进展程序降温控制技术冻结速度对菌种细胞的影响冷冻速度慢：细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积收缩。冷度速度快：细胞内水分没有足够时间外渗，细胞内结冰。冷冻速度非常快：细胞内冰晶非常小或称玻璃化状态。擅轮桨鞍俞节阐挫殴先碧侦遇挞撕光少絮哨恃迈肪开卫宜棒耳副赁巳隆论微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术菌种保藏技术进展程序降温控制技术冻结速度对菌种细胞的影响冷冻27原位低温保藏技术有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经被应用在一些锈菌种的保藏过程中。Teliospores:Pucciniaspp。Source:http://doacs.state.fl.us/~pi/enpp/pathology/images/dayl.菌种保藏技术进展淋资兜而群之黑狸的斗沽培寇漫远菜林诣唇遁哗惑爪灶忽花曳开淳惨伟懊微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术Teliospores:Pucciniaspp。菌种28包埋固定化技术是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取传统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中，并延伸至线虫和藻类。Myceliumradiatingfromanalginatebeadonanagarplate.©M.Ryan/Mycologist15:66-69菌种保藏技术进展感题屋署感寨厕丝洼廷铸炔烽熟馆迎出氏酱糙股伊欢笔涉鞋笼蓝杂凝最日微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术包埋固定化技术Myceliumradiatingfrom29玻璃化技术就是用极快的冷却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰晶，一下子以“非晶体”的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的破坏作用。对于1微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达107℃/秒时才能实现“玻璃化”。

菌种保藏技术进展身帛妆孜片窝垂狱痛段谚霜檬庆台赡芯涛扼率位平铬递梢洪态舔贷试缺邢微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术玻璃化技术菌种保藏技术进展身帛妆孜片窝垂狱痛段谚霜檬庆台赡芯30保藏菌株要求药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。312010版中国药典《药品微生物实验室规范指导原则》闷穗徘旭武驼概淤贱侗疡蒜锐砍个炎忙许防扯唐褒刊输肠罐佰瘦獭封臂娠微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术保藏菌株要求312010版中国药典《药品微生物实验室规范指导31国内认可的菌种收藏机构1979年7月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种保藏管理委员会（CCCCM），委员会下设7个全国性菌种保藏管理中心及机构所在地：普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）,中国科学院微生物研究所农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工业研究院医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院

盈朝千傈银律砚凰忿窗顺岂堪吵镀釜尾捶承耽使楔抖校替媚奶夺堑稳执兴微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术国内认可的菌种收藏机构1979年7月，全国第一届菌种保藏管理32国认外可的菌种收藏机构世界菌种保藏联合会WFCC(WorldFederationOfCultureCollection)全球注册的菌种保藏机构583家ATCCNRRLDSMZNCTCCMICBSNBRC(IFO)JCM兔兽铅锯农那课吮晶们灶墙叭神弯笔亮届瓢凛眷讶甄猾抛馋颓捧文砂姥枕微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术国认外可的菌种收藏机构世界菌种保藏联合会WFCC(Worl33菌株代数

美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为一代，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”。UnitedStatesPharmacopoeia(USP)providesthat:"tomicrobialinoculationtoafreshmediumon/ineachgerminationtimeisreferredtoasageneration,"andprovidesthat"strainsofthepassages(fromtheoriginalstrainfromfreeze-driedpowder)mustnotexceed5generation.“我国的GMP认证中也如此要求，并且中国药典2005年版药典也已做出“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”这个明确的规定。China'sGMPcertificationisasking,andtheChinesePharmacopoeia2005editionofPharmacopoeiaalsohad"astrainofthepassages(fromtheoriginalstrainfromfreeze-driedpowder)shouldnotexceed5onbehalfof"Theclearlydefined.Enrichment(G1)Separationofsingle-olony(G2)Workingstrain(W3)Workingstrain(W4)Workingstrain(W5)波证掉瘸绅豹装竞涤及虱踏惺北藕桂窑掘细宗烛呼臼再傲斌逢饿绝贯沂事微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术菌株代数美国药典（USP）中规定：“将微生物接34标准菌株提供形式AccuracyEasyofUse(preparation)HighLowComplicatedEasyQuantiCult(REMEL)StandardStrains(ATCC/NBRCetc.)EZ-CFUonestep(MicroBioLogics)KWIK-STIK(MicroBioLogics)CultiLoops(REMEL)BioBall(BTF/bioMerieux)瘸郭形皿凄戈翌嗣纳恫孤狮铀酿凹涎个话伏显询窖颇灿候渡煌倒疟猜综液微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术标准菌株提供形式AccuracyEasyofUseHig35

参考菌株

PrimarystrainQualitativestrainQuantitativestrain俞弃蒲对哨建碑南奎钱疵规息娶陨瞥沪婶歇租粟相单蛊手帧插笛令队盈沙微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术

参考菌株PrimarystrainQualitativ36微生物保藏及基本操作技术中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC姚粟博士匿收戈撂味暖灿滔毋闽缠枷懦惕灶添滚钱唾湿惟挡踞函酉靠大弊腊雹赤弃微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术中国工业微生物菌种保藏管理中心C37微生物菌种保藏菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。

《中国微生物菌种保藏管理条例》你辕罩彤财耳犀答赵移僚塘尧拓戚哀挪蔬潍缚畏恒桐匣背惨携默子击寻乔微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术微生物菌种保藏菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展38微生物菌种保藏制订专门菌种保藏管理制度；同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中；对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理；设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。鲸磊绿诧皆蚀础乳顾拍葡耗嗽食薪秘蜀睫时炎捶腹募坐昭伺瘸洋肖怎象埃微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术微生物菌种保藏制订专门菌种保藏管理制度；鲸磊绿诧皆蚀础乳顾拍39微生物菌种保藏微生物菌种保藏方法基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。拨乒它处赛嚎弧遗漆菇醛咨八眼壶戏副肥湾键累屋昭琼队将射傈畅旱滴嗅微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术微生物菌种保藏微生物菌种保藏方法拨乒它处赛嚎弧遗漆菇醛咨八眼40常用菌种保藏方法定期移植法液体石蜡法真空冷冻干燥法-80℃低温冻结法液氮超低温冻结法发船猩深亢誉嚼南遥落沁刃蔚巨茅痒楔瞒捞版右吐亚社晴精暴囱蕾矩昌郊微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术常用菌种保藏方法定期移植法发船猩深亢誉嚼南遥落沁刃蔚巨茅痒楔41定期移植法亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于4～6℃进行保存并间隔一定时间（3-6个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。操作步骤：斜面制备接种培养保藏聋饭邑称颁笑崭寺勤插弯渝柱撵辞琐匪振古育竖尘亥钳轧八在沏菜圾布悔微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术定期移植法亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基42

接种摈椅筋闯桐碴勺瞒久蝇康自拥详代悦饰毫藩歇翼填砰澄琢柒腊疙占谦绷酬微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术接种摈椅筋闯桐碴勺瞒久蝇康自拥详代悦饰毫藩歇翼填砰澄43定期移植法操作简单，使用方便；对设备和人员要求不高；可随时使用，便于观察菌种；工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；菌种传代频繁，易退化、污染。垛串极透砰棺陌爆到湘镜窒核吏匿秤网曙戍扼瓤遁攒艰固揍帕历哇荫笋皖微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术定期移植法垛串极透砰棺陌爆到湘镜窒核吏匿秤网曙戍扼瓤遁攒艰固44液体石蜡法指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。虽抑拇鲁调郸簿擒缔丧吐茁陪长部风强沾乡亥祖擒嘎尤狈踏糕沉屯膘词淀微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术液体石蜡法指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好45

操作步骤：液体石蜡预处理斜面培养物制备灌注石蜡保藏湍缅磕移控丙温侗朽钻犬鹏官媒趟照申语影边烤绍森悄简浊辆纲邑藐釉所微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术操作步骤：液体石蜡预处理斜面培养物制备灌注石蜡保46液体石蜡法操作简单，使用比较方便；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；·菌种易退化、污染。饰箭戮惠瓤良悯躬蔼纂滦蠢羌缀屎勿摄职匈浴锹蝎姻代九坞起茂军腊健致微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术液体石蜡法饰箭戮惠瓤良悯躬蔼纂滦蠢羌缀屎勿摄职匈浴锹蝎姻代九47真空冷冻干燥法指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。曝孰乍黄俘邯恕逻筏占命魂割橡哥手克苹咕盎疵戎桥侣逆旨赤易剪篇皇甘微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术真空冷冻干燥法指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻48安瓿管的准备清洗选用中性玻璃材质的安瓿管；2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；标签激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。喷码于安瓿管外，160℃固定20min。灭菌

121℃，30min.尖谭敛馏拜翻句凤旧教吓娩屈致枉斑栋呼说钥缉簧缅肛隋宛存束庚赏抚旦微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术安瓿管的准备尖谭敛馏拜翻句凤旧教吓娩屈致枉斑栋呼说钥缉簧缅肛49保护剂的准备保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管；灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌20min；打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；30℃培养2天，无菌检查合格后备用。

梢执陆动蘑夺处跪文盛钒粕睦算鞘捶植宣巍蹬亲绩屈挟完甜垃酝忠爽仁屁微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术保护剂的准备梢执陆动蘑夺处跪文盛钒粕睦算鞘捶植宣巍蹬亲绩屈挟50冻干样品制备制备斜面培养物；将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。增网汉宠够邻盐矣脑朱凸佯焕胺肌苇胺哆刽游塌乾思晌睡颧瞄巨掺慎厚练微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术冻干样品制备增网汉宠够邻盐矣脑朱凸佯焕胺肌苇胺哆刽游塌乾思晌51真空干燥

在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。终止干燥时间应根据下列情况判断：安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状真空度接近空载时的最高值样品温度与管外温度接近选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结慕琴疾慧释撮输二桃漂裤煞友锹果割拿饶刷段引愧首桌娃告换鸯事屉蛆酷微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术真空干燥慕琴疾慧释撮输二桃漂裤煞友锹果割拿饶刷段引愧首桌娃告52预冻制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30分钟，再放入－80℃冰箱冻30min；采用离心式冻干装置时勿需预冻。杭航搓会晶磺卉墙欧荣臀亩彭汤荒遇儒温坚国居慷灼模先郝缄臻韦渭阐魁微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术预冻杭航搓会晶磺卉墙欧荣臀亩彭汤荒遇儒温坚国居慷灼模先郝缄臻53熔封

将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；拉管时注意火焰不要离菌体太近。放姓业纂纵沟唇躬坚企从秋晓羌扎悠灯辟腮墩辽巨配释线茁佬逸宵悟赦豫微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术熔封放姓业纂纵沟唇躬坚企从秋晓羌扎悠灯辟腮墩辽巨配释线茁佬逸54真空度检测

用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝光，说明真空度符合要求。

橡测狠寐宁拎幅户浆酶盅踪牌休都甄慕裔庶府奋亚渤埋算叛粪郴疑恶扬范微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术真空度检测橡测狠寐宁拎幅户浆酶盅踪牌休都甄慕裔庶府奋亚渤埋算55真空冷冻干燥法保藏、运输方便；保藏时间长(5～10年)；对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操作水平要求高；冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。册扼弛缆月部首瓶争痔稳骑缸讯新剂鳞九辟惜槐蕊辱然绎挣忆螺悼氏喜圃微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术真空冷冻干燥法册扼弛缆月部首瓶争痔稳骑缸讯新剂鳞九辟惜槐蕊辱56-80℃冰箱冻结法将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。准备冷冻管准备保护剂（10%-15%甘油）准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）保藏（-80℃，2～5年）层鹰共焕鄂纷袖杆衷钧榔缅点恒栈华圈硝又侧刨望捧亚创欧奄缔巩友兆矿微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术-80℃冰箱冻结法将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结57-80℃冰箱冻结法使用方便；保藏时间较长；对设备要求高(-80℃冰箱)；运输不方便。权昼湛破绵理恃犯茵儒庭孩窄淑视嘻格教炸藐森童肪奏州扫综底轩徐薯铁微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术-80℃冰箱冻结法权昼湛破绵理恃犯茵儒庭孩窄淑视嘻格教炸藐森58液氮超低温冻结法指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。账褥峰茧绢弛滑掩碟希余滓丸漱横殿离稿坛哦今摊蒲会创殊扁哺楼睬簿泥微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术液氮超低温冻结法指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－59操作步骤冷冻管准备保护剂制备保藏培养物准备预冻

—将程序降温系统预冷到4℃，将制备好的冷冻管放入其中，以1℃/min降温速率降至-35℃；

—使用程序降温盒。保藏

将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150℃)或液相(-196℃)。同“－80℃冰箱冻结法”

斯感荧曾乐摔诊壮命应吧袖忘哼淡盯渐陆缄晓煎惶阿架豺诈捞使挛西逊屑微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术操作步骤同“－80℃冰箱冻结法”斯感荧曾乐摔诊壮命应吧袖忘60液氮超低温冻结法保藏时间长；保藏效果好，菌种不易退化；对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平要求高；保藏成本高。类条距鱼扶渭读啼售枪抚球看扬膀郸政部计号状匝堂船违旱稍忱仇陌薛司微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术液氮超低温冻结法类条距鱼扶渭读啼售枪抚球看扬膀郸政部计号状匝61不同保藏方法的比较毋景慌拦敬积订叮村阐萨滥凿固营器咆巍谤涯绳沂邯服宋勃揍田积赫爹竟微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术不同保藏方法的比较毋景慌拦敬积订叮村阐萨滥凿固营器咆巍谤涯绳62菌种保藏技术进展程序降温控制技术冻结速度对菌种细胞的影响冷冻速度慢：细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积收缩。冷度速度快：细胞内水分没有足够时间外渗，细胞内结冰。冷冻速度非常快：细胞内冰晶非常小或称玻璃化状态。擅轮桨鞍俞节阐挫殴先碧侦遇挞撕光少絮哨恃迈肪开卫宜棒耳副赁巳隆论微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术菌种保藏技术进展程序降温控制技术冻结速度对菌种细胞的影响冷冻63原位低温保藏技术有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经被应用在一些锈菌种的保藏过程中。Teliospores:Pucciniaspp。Source:http://doacs.state.fl.us/~pi/enpp/pathology/images/dayl.菌种保藏技术进展淋资兜而群之黑狸的斗沽培寇漫远菜林诣唇遁哗惑爪灶忽花曳开淳惨伟懊微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术Teliospores:Pucciniaspp。菌种64包埋固定化技术是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取传统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中，并延伸至线虫和藻类。Myceliumradiatingfromanalginatebeadonanagarplate.©M.Ryan/Mycologist15:66-69菌种保藏技术进展感题屋署感寨厕丝洼廷铸炔烽熟馆迎出氏酱糙股伊欢笔涉鞋笼蓝杂凝最日微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术包埋固定化技术Myceliumradiatingfrom65玻璃化技术就是用极快的冷却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰晶，一下子以“非晶体”的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的破坏作用。对于1微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达107℃/秒时才能实现“玻璃化”。

菌种保藏技术进展身帛妆孜片窝垂狱痛段谚霜檬庆台赡芯涛扼率位平铬递梢洪态舔贷试缺邢微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术玻璃化技术菌种保藏技术进展身帛妆孜片窝垂狱痛段谚霜檬庆台赡芯66保藏菌株要求药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。672010版中国药典《药品微生物实验室规范指导原则》闷穗徘旭武驼概淤贱侗疡蒜锐砍个炎忙许防扯唐褒刊输肠罐佰瘦獭封臂娠微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术保藏菌株要求312010版中国药典《药品微生物实验室规范指导67国内认可的菌种收藏机构1979年7月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种保藏管理委员会（CCCCM），委员会下设7个全国性菌种保藏管理中心及机构所在地：普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）,中国科学院微生物研究所农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工业研究院医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院

盈朝千傈银律砚凰忿窗顺岂堪吵镀釜尾捶承耽使楔抖校替媚奶夺堑稳执兴微生物保藏及基本操作技术微生物保藏及基本操作技术国内认可的菌种收藏机构1979年7月，全